麋鹿隐孢子虫病的检测方法 毕业论文

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引言隐孢子虫（Cryptosporidium）是细胞内寄生原虫，能感染人与多种动物的消化道和呼吸道而引起隐孢子虫病（Cryptosporidiosis)[1]。自从Tyzzer[2]在小鼠粘膜组织中发现小鼠隐孢子虫(C.muris)以来，隐孢子虫已经被认为是世界脊椎动物中的一种广泛传播的重要寄生虫，包括中国在内，隐孢子虫已经在世界上六个大洲90个国家发现[3,4,5]，并经常在婴儿和儿童中发现。现今被公认的隐孢子虫有14种，其传播途径以卵囊经粪-口途径为主[6,7]。与其它介水传播性原虫相比，隐孢子虫因粒径小于10µm和自身对消毒药的较强抵抗力而被净水工艺除去的难度更大，即使在滤过水中，卵囊的检出率在英国和美国分别达到37%和26%，因此，隐孢子虫污染已经成为水源监测的重要指标[6,8]。如今，隐孢子虫能感染包括人在内的240多种动物，其中包括野禽、两栖动物等许多野生动物，是现今引起动物腹泻的主要病原之一，严重威胁着人和动物的健康，造成了巨大的经济损失。麋鹿属于国家一级保护动物，是中国特有的动物，也是世界珍稀动物，曾经是国际自然保护联盟IUCN(WorldConservationUnion）红皮书规定的极危物种。目前，虽然世界的麋鹿总数已经繁殖达4000头，但仍然是濒危物种。近几年来,隐孢子虫屡次在野生和人工饲养的多种鹿类中发现，严重威胁着鹿的健康，而至今未见关于麋鹿隐孢子虫病的调查。因此，积极开展麋鹿隐孢子虫病的流行病学调查，对其防治有着重要的意义。1材料与方法1.1样品采集与保存从2010年到2011年，应用一次性手套，采集北京与大丰麋鹿自然保护区自然环境中新鲜的麋鹿粪便，编号，置于冰壶，并同时记录粪便的颜色与性状。其中，北京采集样品23个，大丰87个。样品处理前，4℃低温保存。1.2试剂改良抗酸染色液：甲液(石炭酸复红4g，95%乙醇20ml，苯酚8g，双蒸水100ml)，乙液(纯硫酸10ml,蒸馏水90ml)，丙液(0.2g孔雀绿，蒸馏水100ml)。饱和盐水(1000ml水加热至沸腾加氯化钠至不溶为止)。胎牛血清、甲醇、蒸馏水。7 1.3试验材料载玻片、盖玻片、20ml试管数只、试管架、酒精灯、镊子、一次性手套、口罩、锥形瓶、烧杯、EP管(0.5ml、0.2ml、7ml、10ml)、移液器、枪头、记号笔、过滤纱布、漏斗、玻璃棒、标签纸等。1.4试验仪器及设备光学显微镜(OLYMPUS-XDS-1B)、数码相机(OLYMPUS)、通风橱(苏净集团安泰公司制造)、可调万用电炉(龙口市电路制造厂)、电子天平(上海精天电子仪器有限公司)、离心机(湖南星科科学仪器有限公司)1.5试验方法通过饱和盐水漂浮法和改良抗酸染色法来对麋鹿隐孢子虫卵囊进行检查。具体操作步骤如下所述。1.5.1饱和盐水漂浮法按编号取麋鹿粪样3g于20ml试管中，将试管依次编号，加入已经配制好的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌，静置15~30min后，过滤至已编号的待用试管中。将滤液5ml一一对应倒入已编号的10mlEP管中，加水适量，放入离心机，3000r/min，离心10min。取出弃掉上清液，用移液器取5ml蒸馏水加入与管内离心剩余物充分混匀，重复以上离心步骤。取出后弃去上清液，用移液器取200μl蒸馏水与离心产物混匀，取出放入500μlEP管中置于4℃冰箱中保留备样。用移液器取2μl牛血血清与载玻片上，按编号依次取20μl漂浮液与之混合，盖上盖玻片，40倍物镜镜检。1.5.2改良抗酸染色法按编号取麋鹿粪样3g于20ml试管中，将试管依次编号，加入已经配制好的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌，静置15~30min后,过滤至已编号的待用试管中。之后，将过滤液5ml一一对应倒入已编号的10mlEP中，加水适量，放入离心机离心，要求转速3000r/min,离心10min后，取出弃掉上清液，用移液器取5ml蒸馏水加入与管内离心剩余物充分混匀，之后再重复以上离心步骤。取出后弃去上清液，用移液器取200μl蒸馏水与离心产物混匀，之后取出放入500μlEP管中置于4℃冰箱中保留备样。用移液器取2μl牛血血清与载玻片上，按编号依次取20μl漂浮液与之混合，涂成直径约为1cm7 大小的圆，用标签纸将载玻片编号，待其自然干燥后，用酒精灯进行固定，之后进行染色。先用甲液染色5min，水洗，再滴加乙液，脱色2~5min，水洗之后，再滴加丙液30s，之后水洗晾干即可镜检。1.6检测指标1.6.1麋鹿隐孢子虫的感染强度隐孢子虫感染强度的判定主要是根据有关文献资料的判定标准,并做相应的改进。用40倍物镜观察每个粪样的3张涂片，发现卵囊即为阳性。1-5个卵囊表示为“+”，6-10个卵囊为“++”，11-15个卵囊为“+++”，16-20个卵囊为“++++”，>20卵囊为“+++++”。未发现卵囊者为阴性“-”。1.6.2虫种的形态学观察随机选择6个分离株分离纯化的卵囊，在光学显微镜下，分别测量10个卵囊的长、短径，计算卵囊指数，将卵囊指数和所测长短径值，并观察隐孢子虫卵囊的染色特征和直接镜检时的内部形态特征进行鉴定。1.7统计分析试验结果统计分析采用SPSS12.0和MicrosoftOfficeExcel2003软件，阳性率和发生率的比较采用χ2检验(α=0.05)。2结果与分析2.1麋鹿隐孢子虫卵囊形态学卵囊在40倍光学显微镜下观察，可见卵囊呈圆形、扁圆形或椭圆形，卵囊最外层有一薄的卵囊壁，卵囊内部结构有呈月牙形的子孢子，圆点状的残留体(图1)。经MAFS染色的卵囊呈圆形、扁圆形或椭圆形，外有一层透明的卵囊壁，在黄绿色或蓝绿色背景下，卵囊呈粉红色到鲜艳的玫瑰红色(图2)。7 图1图2图140倍普通光学显微镜下，饱和盐水漂浮法分离纯化的麋鹿隐孢子虫卵囊，米粒样大小。图2在40倍普通光学显微镜下，经MAFS染色的麋鹿粪样的隐孢子虫卵囊，在蓝绿色背景下呈粉红色至鲜艳的玫瑰红色。2.2麋鹿隐孢子虫卵的大小在100倍物镜下，隐孢子虫卵囊长径在4.78μm-4.94μm之间，短径在4.08μm-4.37μm之间，卵囊指数在1.12到1.18之间。2.3麋鹿隐孢子虫感染图3不同季节麋鹿隐孢子虫的感染率2.3.1感染率和感染强度在采集的110份麋鹿粪样中，12份检测到隐孢子虫卵囊，总阳性率为10.90%7 。在所有的12份阳性样品中，感染强度“+”和“++”的有10个和2个，分别占了总感染率的83.33%和16.67%。北京地区检出的阳性率为8.70%（2/23），大丰地区检出的阳性率为11.49%（10/87），感染率之间差异不显著(χ2=0.13，P>0.05)。2.3.2感染的季节性从春季到冬季，麋鹿隐孢子虫的感染率分别为6.25%(1/16)、12.00%(3/25)、17.39%(4/23)和8.70%(4/46)，如图3所示。各季节感染率之间差异不显著(χ2=0.0-1.99，P>0.05)。3结论与讨论3.1麋鹿隐孢子虫病的检测方法的可行性3.1.1饱和盐水漂浮法本法为寄生虫病实验室检查的常规方法之一，本文在常规饱和盐水漂浮法的基础上，取上清液于离心机中进行两次离心，使粪便中虫卵囊充分沉淀，保证足够的卵囊数量，便于镜检和提高隐孢子虫卵囊检出率。3.1.2改良抗酸染色法抗酸染色原理已经研究得较为透彻，一般认为抗酸性菌体或虫卵内含脂类物质较多(含量可高达40%)，此物质具抗酸的性质。染色时，它与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性酒精的脱色作用，同时脂类又不易过细胞膜,不能被脱色，因此抗酸菌能保持复红的颜色。相反,非抗酸性菌体内含脂类少，易被酸酒精脱色，脱色时又易从细胞膜渗出而脱掉,最后被复染成蓝绿色。隐孢子虫卵囊内的脂类含量较高，其中孢子化小球隐孢子虫卵囊大约含有1.2×10-9μmol磷脂，卵磷脂占66%，对抗酸染色法具有特异性和敏感性。经抗酸染色、脱色等步骤后，卵囊被染成玫瑰红色，隐孢子虫卵囊被染成紫红色或玫瑰红色，背景为蓝绿色。卵囊圆形或椭圆形，直经2~3μm。仔细观察，有的卵囊可见到子孢子，该染色法较为常用，效果尚好。但由于染色和脱色时间不同，卵囊着色结果不完全一致，有些卵囊着色深，结构清晰，有些卵囊染色淡，结构模糊，如果被检验的材料保存时间较长，2~3d以后，则卵壁染色不均，卵囊像半月形，细胞仅部分着色。涂片在硫酸里不充分脱色时，菌丛、酵母和真菌也可能染成玫瑰红色，但它们内无结构，7 可根据它们的形态和大小与隐抱子虫卵囊相区别。通常情况下酵母孢子染成蓝色，与玫瑰红色的卵囊截然不同。3.1.3两种方法结合的优点在本文对麋鹿隐孢子虫病检测的研究中，将饱和盐水漂浮法和抗酸染色法两种方法结合起来，方法确实，便于镜检和提高隐孢子虫卵囊的检出率。能够发现和区分隐孢子虫卵囊在两种状态下的形态结构，提高了试验的检出效率。3.2麋鹿隐孢子虫感染3.2.1麋鹿隐孢子虫感染的地域性本研究发现，在采集的110份麋鹿粪样中，12份检测到麋鹿隐孢子虫卵囊，其中北京地区检出的阳性率低于大丰地区检出的阳性率，二者之间差异不显著。说明，麋鹿隐孢子虫感染无地域性。3.2.2麋鹿隐孢子虫感染率与季节的关系Yu等(2004)报道认为隐孢子虫感染率夏季（22.1%）高于冬季（12.7%）[9]，Chai等[10]除报到春天明显高于夏季和冬季，而且此季节性与温度不相关，而与降雨量存在一定的相关性；而Sanford等报道没有发现隐孢子虫感染的季节性[11]。与这些报道不同的是，本试验中发现隐孢子虫感染率秋季最高，春季最低，各季节感染率之间差异不显著。因此，感染无季节性。3.2.3麋鹿隐孢子虫的感染强度本研究发现，在采集的110份麋鹿粪样中，12份检测到隐孢子虫卵囊，总阳性率为10.90%。在所有的12份阳性样品中，感染强度主要是低强度感染。由此提示，麋鹿感染隐孢子虫病广泛存在，但是大多数的感染强度是较低的。4小结本文应用改良抗酸染色法对大丰地区和北京地区麋鹿隐孢子虫病流行病学情况进行调查发现，大丰地区和北京地区存在麋鹿隐孢子虫病的感染率较高，但是大多数感染强度较低，发生无季节性和地域性。参考文献：[1]WidmerG,FengX,TanriverdiS.GenotypingofCryptosporidiumparvumwithmicrosatellite7 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