麋鹿隐孢子虫病的检测方法 毕业论文

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1、引言隐孢子虫（Cryptosporidium）是细胞内寄生原虫，能感染人与多种动物的消化道和呼吸道而引起隐孢子虫病（Cryptosporidiosis)[1]。自从Tyzzer[2]在小鼠粘膜组织中发现小鼠隐孢子虫(C.muris)以来，隐孢子虫已经被认为是世界脊椎动物中的一种广泛传播的重要寄生虫，包括中国在内，隐孢子虫已经在世界上六个大洲90个国家发现[3,4,5]，并经常在婴儿和儿童中发现。现今被公认的隐孢子虫有14种，其传播途径以卵囊经粪-口途径为主[6,7]。与其它介水传播性原虫相比，隐孢子虫因粒径小于10µm和自身对消毒药的较强抵抗力而被净水

2、工艺除去的难度更大，即使在滤过水中，卵囊的检出率在英国和美国分别达到37%和26%，因此，隐孢子虫污染已经成为水源监测的重要指标[6,8]。如今，隐孢子虫能感染包括人在内的240多种动物，其中包括野禽、两栖动物等许多野生动物，是现今引起动物腹泻的主要病原之一，严重威胁着人和动物的健康，造成了巨大的经济损失。麋鹿属于国家一级保护动物，是中国特有的动物，也是世界珍稀动物，曾经是国际自然保护联盟IUCN(WorldConservationUnion）红皮书规定的极危物种。目前，虽然世界的麋鹿总数已经繁殖达4000头，但仍然是濒危物种。近几年来,隐孢子虫屡次在

3、野生和人工饲养的多种鹿类中发现，严重威胁着鹿的健康，而至今未见关于麋鹿隐孢子虫病的调查。因此，积极开展麋鹿隐孢子虫病的流行病学调查，对其防治有着重要的意义。1材料与方法1.1样品采集与保存从2010年到2011年，应用一次性手套，采集北京与大丰麋鹿自然保护区自然环境中新鲜的麋鹿粪便，编号，置于冰壶，并同时记录粪便的颜色与性状。其中，北京采集样品23个，大丰87个。样品处理前，4℃低温保存。1.2试剂改良抗酸染色液：甲液(石炭酸复红4g，95%乙醇20ml，苯酚8g，双蒸水100ml)，乙液(纯硫酸10ml,蒸馏水90ml)，丙液(0.2g孔雀绿，蒸馏水

4、100ml)。饱和盐水(1000ml水加热至沸腾加氯化钠至不溶为止)。胎牛血清、甲醇、蒸馏水。71.3试验材料载玻片、盖玻片、20ml试管数只、试管架、酒精灯、镊子、一次性手套、口罩、锥形瓶、烧杯、EP管(0.5ml、0.2ml、7ml、10ml)、移液器、枪头、记号笔、过滤纱布、漏斗、玻璃棒、标签纸等。1.4试验仪器及设备光学显微镜(OLYMPUS-XDS-1B)、数码相机(OLYMPUS)、通风橱(苏净集团安泰公司制造)、可调万用电炉(龙口市电路制造厂)、电子天平(上海精天电子仪器有限公司)、离心机(湖南星科科学仪器有限公司)1.5试验方法通过饱和

5、盐水漂浮法和改良抗酸染色法来对麋鹿隐孢子虫卵囊进行检查。具体操作步骤如下所述。1.5.1饱和盐水漂浮法按编号取麋鹿粪样3g于20ml试管中，将试管依次编号，加入已经配制好的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌，静置15~30min后，过滤至已编号的待用试管中。将滤液5ml一一对应倒入已编号的10mlEP管中，加水适量，放入离心机，3000r/min，离心10min。取出弃掉上清液，用移液器取5ml蒸馏水加入与管内离心剩余物充分混匀，重复以上离心步骤。取出后弃去上清液，用移液器取200μl蒸馏水与离心产物混匀，取出放入500μlEP管中置于4℃冰箱中保留备样。用移

6、液器取2μl牛血血清与载玻片上，按编号依次取20μl漂浮液与之混合，盖上盖玻片，40倍物镜镜检。1.5.2改良抗酸染色法按编号取麋鹿粪样3g于20ml试管中，将试管依次编号，加入已经配制好的饱和盐水，用玻璃棒充分搅拌，静置15~30min后,过滤至已编号的待用试管中。之后，将过滤液5ml一一对应倒入已编号的10mlEP中，加水适量，放入离心机离心，要求转速3000r/min,离心10min后，取出弃掉上清液，用移液器取5ml蒸馏水加入与管内离心剩余物充分混匀，之后再重复以上离心步骤。取出后弃去上清液，用移液器取200μl蒸馏水与离心产物混匀，之后取出放

7、入500μlEP管中置于4℃冰箱中保留备样。用移液器取2μl牛血血清与载玻片上，按编号依次取20μl漂浮液与之混合，涂成直径约为1cm7大小的圆，用标签纸将载玻片编号，待其自然干燥后，用酒精灯进行固定，之后进行染色。先用甲液染色5min，水洗，再滴加乙液，脱色2~5min，水洗之后，再滴加丙液30s，之后水洗晾干即可镜检。1.6检测指标1.6.1麋鹿隐孢子虫的感染强度隐孢子虫感染强度的判定主要是根据有关文献资料的判定标准,并做相应的改进。用40倍物镜观察每个粪样的3张涂片，发现卵囊即为阳性。1-5个卵囊表示为“+”，6-10个卵囊为“++”，11-15

8、个卵囊为“+++”，16-20个卵囊为“++++”，>20卵囊为“+++++”。未发现卵囊者为