elisa方法诊断隐孢子虫抗原

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1、单抗介导的夹心ELISA方法的建立摘要:将纯化的隐孢子虫卵囊制备免疫原,经油相苗、水相苗共6次免疫,制备了兔抗安氏隐孢子虫抗体。提纯后用HRP标记IgG抗体,标记后的HRP浓度为1.4mg/mL,IgG浓度为1.755mg/mL,酶/抗体摩尔比为1.18。选用3B10单抗与酶标兔抗建立了夹心ELISA试验,单抗的最佳稀释度为1:200,酶标抗体的工作浓度为1:400~800。在3种待检样品的处理方法中,以样品经超声波破碎后置液氮--37℃反复冻融后再检测,效果最好;乙醚脱脂处理后再同上处理,结果OD值稍低;未经冻融处理的隐孢子虫卵囊液比

2、同滴度的处理样品OD值显著偏低。夹心ELISA最低检出限为含100个卵囊/mL粪样。特异性试验表明:该方法对于同属于隐孢子虫属的猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫有较高的识别力,其OD值与牛C.andersoni接近,而卵囊浓度相同的鸡球虫和猪等孢球虫的OD值则显著偏低。引言目前,隐孢子虫的诊断方法主要有直接镜检、染色镜检、免疫学方法(如ELISA和IFAT)及PCR方法等。目前研究较多的是免疫学方法和分子生物学方法。1990年Robert报道了检测牛粪便中卵囊抗原的ELISA方法,取得了较好的效果。目前,国外已有商品ELISA检测试剂盒。国

3、内张西臣1996年报道了双抗体夹心ELISA检测病原的初步研究,尹继刚应用双夹心-ELISA对60份牛粪便样本检查,并与抗酸染色法比较发现,ELISA敏感性比抗酸染色强,且不与牛球虫、结肠小袋虫发生类属反应。作者在前两个试验的基础上,初步进行了夹心ELISA试验,为今后制备诊断试剂盒,用于水源、环境中隐孢子虫的检测做前期的准备。1.材料与方法1.1材料1.1.1单抗与多抗抗牛源安氏隐孢子虫的单克隆抗体制备见实验二,使用的为其中的3B10单抗,上清效价为6400,腹水效价为102400。多抗为兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体,琼扩效价为1:8。酶

4、标单抗和酶标多抗均为自己标记。酶标羊抗鼠二抗购自北京中山金桥生物公司。1.1.2实验动物健康无隐孢子虫的雄兔和雌兔各一只,购自中牟县某养兔场,各种隐孢子虫、球虫、猪等孢球虫均为本实验室分离保存。121.1.3 试剂及器材:1.1.3.1抗体提纯试剂及器材同实验二1.1.3.2标记试剂及器材  (1) 0.1MNaIO4:称取241mg高碘酸钠(上海浦东化学试剂厂20010523)溶于蒸馏水10mL中。  (2) 1mMPH4.4醋酸钠缓冲液:  0.2MNaAc(天津科密欧化学试剂开发中心20031107)(1.361克/50mL)3.

5、7mL  0.2MHAc(0.601mL/50mL)6.3mL  加蒸馏水至2,000mL。  (3) 0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液:  Na2CO30.32克  NaHCO30.586克  加蒸馏水至50mL  再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01MPH9.5的碳酸盐缓冲液。  (4) NaBH4(FLUKA进口分装20040726)溶液(4mg/mL):  临用时称取NaBH44mg溶于1mL蒸馏水中。  (5) 0.01MPH7.4PBS。  (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。  (7) 萘氏试剂  (8) 纯

6、化的兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体。  (9) HRP(上海雪满生物科技有限公司20041228,RZ>3.0,酶活力:300u以上/mg)。  (11)搅拌器,分光光度计,离心机。  (12)透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。1.1.3.2ELISA试剂及器材见实验二  1.2方法1.2.1兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体的制备隐孢子虫抗原,采自西郊某奶牛场阳性牛,经蔗糖浓度梯度离心纯化后,用PBS调整卵囊浓度为2×108个/mL左右。将上述提纯卵囊置超声波细胞粉碎仪上以80%的功率粉碎6分钟,然后将粉碎物置液氮和和37℃冻融5-6次,经350

7、0rmin-1离心10分钟,测定上清中性液蛋白含量,可溶性抗原用于抗体检测,使用部分可溶性抗原和全部沉淀(非可溶性抗原)制备免疫原。将上述抗原的一部分(冻融的上清和破碎的卵囊碎片)混合物加2倍量的弗氏完全佐剂乳化制成油苗。另一部分不加油佐剂,作为水苗。12免疫,首先用油苗免疫,每只兔子免疫1mL,背部皮下多点注射和腹腔注射相结合。免疫兔用全价饲料饲养于清洁动物房内。免疫兔从颈静脉放血,血液置于灭菌平皿中,于37℃自然析出血清。1.2.2兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体的提纯参照实验二的方法提纯和测定兔抗体的浓度。1.2.3IgG抗体的标记参

8、照董邦全[54]的方法略加改进,标记步骤如下:(1)称取5mgHRP溶解于1mL双蒸水中。(2)于上液中加入0.2mL新配的0.1MNaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中,对1

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