牛微小隐孢子虫感染ELISA和胶体金层析试纸条检测方法的建立

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1、分类号：S855.9+9单位代码：10183研究生学号：2016854016密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）牛微小隐孢子虫感染ELISA和胶体金层析试纸条检测方法的建立DevelopmentofELISAandColloidalGoldImmunochromatographicStripsforTheDetectionofCryptosporidiumparvuminbovine作者姓名：邰利鑫类别：兽医硕士领域（方向）：疫病防控指导教师：张西臣教授培养单位：动物医学学院2018年6月牛微小隐孢子虫感染

2、ELISA和胶体金层析试纸条检测方法的建立DevelopmentofELISAandColloidalGoldImmunochromatographicStripsforTheDetectionofCryptosporidiumparvuminbovine作者姓名：邰利鑫领域（方向）：疫病防控指导教师：张西臣教授类别：兽医硕士答辩日期：2018年6月6日国家重点研发计划课题（2017YFD0501305）Thisworkwassupportedby“TheNationalKeyResearchandDevelop

3、mentProgramofChina”(GrantNo.2017YFD0501305)未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使。。用不在此限）否则，应承担侵权的法律责任吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明，，：所呈交学位论文是本人在指导教师的指导下独立进行研究工作所取得的成果３除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其

4、他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明Ｄ本人完全意识到本声明的法侓结果由本人承担。学位论文作者签名曰期？（月？年／。曰中文摘要牛微小隐孢子虫感染ELISA和胶体金层析试纸条检测方法的建立隐孢子虫病是一种呈全球分布的人兽共患寄生虫病，牛可感染多种类型隐孢子虫，主要包括安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫等，其中微小隐孢子虫感染最为广泛，犊牛感染后出现腹泻、营养不良等症状，且对人类健康危害最为严重。近年来随着养牛业的

5、迅速发展，牛成为人患微小隐孢子虫病的主要来源，且目前尚无微小隐孢子虫的特效药物和疫苗，所以建立快速准确的牛微小隐孢子虫诊断方法，对畜牧业的发展和人类健康安全意义重大。近年来发现在微小隐孢子虫的卵囊中存在一种病毒，即为微小隐孢子虫病毒（Cryptosporidiumparvumvirus,CSpV1），其在卵囊中存在稳定，且数量较多，可作为牛感染微小隐孢子虫的重要检测指标。本研究选用实验室制备保存的微小隐孢子虫病毒单克隆抗体作为捕获抗体，本实验制备的兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体作为检测抗体，建立三种检测牛

6、粪便样品的微小隐孢子虫感染免疫学诊断方法并进行对比分析，为今后牛微小隐孢子虫的动态监测提供参考。双抗夹心ELISA检测方法的建立：首先表达微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白，制备并纯化出兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体，以微小隐孢子虫病毒5#单克隆抗体作为捕获抗体，HRP标记兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体作为检测抗体，建立牛微小隐孢子虫感染双抗夹心ELISA检测方法。通过各项条件的摸索优化，确定微小隐孢子虫病毒单克隆抗体的最佳包被量为0.25μg/孔；待检粪便样品的最佳稀释度为1：4稀释；HRP标记兔抗微小隐

7、孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体的最佳稀释度为1：200；敏感度可达到1：160；选取牛安氏隐孢子虫感染阳性参照粪便样品和牛贾第虫感染阳性参照粪便样品进行特异性试验，结果未出现交叉反应；采用不同批次的酶标板进行批间和批内重复试验，测得批内重复变异系数小于6%，批间重复试验的变异系数小于9%；应用已建立的牛微小隐孢子虫双抗夹心ELISA方法，检测长春地区120I份粪便样品，并与市售微小隐孢子虫双抗夹心ELISA试剂盒作为比较，本方法检测出6份阳性样品，阳性率为5%(6/120)，市售ELISA试剂盒检出4份阳性样品，阳

8、性率为3%(4/120)。Dot-ELISA检测方法的建立：使用NC膜作为载体，利用微小隐孢子虫病毒5#单克隆抗体和HRP标记的兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体建立牛微小隐孢子虫感染Dot-ELISA检测方法。确定粪便样品的最佳稀释比例是1：16；HRP标记微小隐孢子虫病毒多抗最佳稀释比例为1：500；微小隐孢子虫病毒单克隆抗体的最佳包被量0.5μg/片；敏感性为1