猴b病毒囊膜糖蛋白gd基因的克隆表达及间接elisa方法的建立

《猴b病毒囊膜糖蛋白gd基因的克隆表达及间接elisa方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、西南大学硕士学位论文猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立姓名：张文韬申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：聂奎；叶华虎20120601中文摘要猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立预防兽医学专业硕士研究生张文韬指导教师聂奎教授叶华虎副研究员猴B病毒(Monl(eyBVirus)属于洳疱疹病毒亚科，单纯疱疹病毒属成员，是一种以猴(特别是猕猴属)为自然宿主的动物源性病原体。猴B病毒在其自然宿主中的感染率大于60％，但多呈隐性感染。该病毒感染非自然宿主(人和其他动物)的致死性强，感染病例的病死率超过80％，即使幸存也会留下失语、

2、瘫痪等严重的神经后遗症。流行病学调查显示，猴B病毒主要以接触感染为主，被感染猴抓伤、咬伤都有可能感染猴B病毒，也有人传人和虫媒传播等报道。灵长类的人和猴感染猴B病毒后，一旦出现IIi；i床表现，表明病毒已侵入神经系统，治疗便失去了意义。因此，建立快速鉴别诊断的方法，对猴B病毒早期的诊断与治疗有重要意义。由于猴B病毒与在脊椎动物(包括人类)中广泛感染的其他小疱疹病毒(特别是人单纯疱疹病毒，HSV)高度同源，表现出较强的交叉反应，因此，这类疱疹病毒成为了现阶段猴B病毒快速鉴别诊断的土i要障碍。由于受HSV和猴B病毒的感染特点等因素影响，目前所建立的猴B病毒检测方法都达不到快速、特异

3、之H的。临床医学中常用狒狒疱疹病毒4(Herpesviruspapio2，HVP-2)、猴因子8(simianagent8，SA8)和HSV等病毒蛋白作诊断抗原检测猴B病毒，但其检测的灵敏度低。也有人研制了猴B病毒灭活疫苗，但该疫苗保护率低于50％。近年来，随着对猴B病毒结构研究的不断深入，特别是猴B病毒的全基因组测序的完成，囊膜糖蛋白(glycoprotein)逐渐成为猴B病毒诊断和防治研究的书要靶点。糖蛋向D和B是灵长类动物受到t1．疱疹病毒感染后免疫应答的书要标靶，gD和gBl'l‘J抗体最先出现在急性或再发性人类HSV感染的血清中，并且达到很高效价，也可以保持2年之久。

4、gB是导致灵长类疱疹病毒之间J-．泛抗原交叉反应的t要原凶，而gDOd的氨基酸序列相对保守，推断猴B病毒gD蛋白可以刺激机体产生特异性抗体。鉴于猴B病毒囊膜糖蛋臼在鉴别诊断过程中的重要作用．本试验从以下方1lIi展开工作：(1)比较猴B病毒与HSV·1和HSV-2三种囊膜糖蛋白gB、gC和gD的I_J源性差异，分析猴西南大学硕士学位论文B病毒囊膜糖蛋白gD基因序列；(2)从中国源恒河猴B病毒的感染组织中克隆gD胞外区基因，分析其序列特征：(3)对目的基因——猴B病毒gD基因进行原核表达：(4)以纯化后的重组gD蛋白为包被抗原，建立检测猴B病毒抗体的间接ELISA法。1．猴B病毒

5、囊膜糖蛋白生物信息学分析采用DNAMAN软件比较猴B病毒、HSV-I和HSV-23种弘疱疹病毒中囊膜糖蛋白(gB、gC丰qlgD)的I司源性差异，发现猴B病毒囊膜糖蛋白gB与HSVol、HSV-2的同源性为78％、77％，gC与HSV-1、HSV-2的同源性为42％、48％，gD与HSV-!、HSV-2的I一源性为56％、58％。有研究表f1)JgB是导致灵长类疱疹病毒之问广泛抗原交叉反应的主要原因，而gDqa的氨基酸序列却更加保守。本实验室研究人员前期获得了重组表达的猴B病毒囊膜糖蛋白gC并建立了gC．ELISA检测方法，gc．ELISA的灵敏度和特异度分别为94．1％和10

6、0％。因此，本试验以猴B病毒囊膜糖蛋白gD作为研究对象。利用生物信息学方法对猴B病毒囊膜糖蛋I二lgD结构、亲水性、表面可及性、抗原性指数、柔韧性以及B细胞表位等参数进行分析和预测，结果显示：该蛋白的信号肽位于N端1．24氨基酸，胞外区位于N端25．341氨基酸，跨膜区位于N端342．364氨基酸，胞内区位于N端365．394氨基酸；蛋白分子的柔性结构区域分布均匀，亲水性较好，表面可及性较高：区段24--44、49--60、49---76、107～118、141～150、164--174、206--214、287～308、322～339希1365～382的平均性抗原指数分别为0

7、．983、1．854、0．901、1．763、1．62、1．1、2．028、0．979、0．676和1．148，提示B细胞抗原表位在这些区段的可能性较大。本试验最终选择猴B病毒囊膜糖蛋AgDI￥J胞外区作为筛选高效表达的抗原候选片段。2．猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因克隆及特征分析根据NCBI公布的猴B病毒标准株E2490的全基因序列，以猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因胞外区为目的片段，利用BioXM2．6软件分析该序列的酶切位点，发现该序列存在包括Sinai、Sacll等在内的203个常见酶，而Nd