高糖高胰岛素诱发的胰岛素抵抗与大鼠血管内皮依赖性血压调节关系的实验研究

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墨星垦型查堂堡圭兰堡丝苎主塞塑墨中英文对照表ATII：AngiotensinIIACEl：AngiotensinCoVertingBnzymeInhibitorN0：NitricOxideNOS：Nitric弧ideSynthaseIns：insulinSOD：SuperoxideDismutasesGc：solubleGuanylateCyclasecGMP：guanosine3’5’cyclicmonophosphateGSH：嘣luced咖taⅡlioneh咖o∞IR：InsulinResistanceAch：acetylcllolineSNP：sodiumnitroprussideROS：reactiveoxygenspeciesNADPH：reducedfo肌of懒tin棚nidead锄ir旧diInlcleotidephosphateNADH：nicodn锄ideadeflinemdeotide．r镬如硪菇P13一K：phosphoinositidekinase3IRS：InsulinReceptorsllbsn吼e血管紧张素II血管紧张素转化酶抑制剂一氧化氮一氧化氮合酶胰岛素超氧化歧化酶可溶性鸟苷酸环化酶环鸟苷酸还原型谷胱甘肽胰岛素抵抗乙酰胆碱硝普钠活性氧簇还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型辅酶Ⅱ)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷脂酰肌醇3激酶胰岛素受体底物 学位论文原创性l声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者虢二峰瞧礴㈨1日学位论文版权使用授权书本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。⋯名：蛐翩警气嗍彬佩媚 天津医科大学硕士学位论文中文摘要摘要研究背景t代谢综合征(MS)是近年来国内外共同关注的热点话题，它与多种代谢相关疾病有密切关系。1988年Reaven提出将高血压、中心性肥胖、血脂紊乱、高血糖集中发生于同一个体的情况命名为“x综合征”，并指出其发病基础为胰岛素抵抗(IR)。尽管IR与高血压的因果关系尚不明确，但多数观点认为IR是高血压的发病机制之一。血管内皮细胞可产生一系列血管活性物质，舒张血管物质如NO、前列环素、缓激肽等；缩血管物质如血管紧张素II(ATII)、内皮素(ET)等，正常情况下血管张力的维持依赖于血管舒张物质和收缩物质的平衡。IR时二者失平衡及内皮功能障碍是导致高血压的主要原因。越来越多的报道指出氧化负荷在心血管疾病(包括高血压)的病理过程中发挥重要作用。另外，血管活性物质ATII，高胰岛素等都被认为在胰岛索抵抗导致的高血压中发挥重要作用。本研究以sD大鼠为研究对象，分别给予不同的干预措施，通过观察各组大鼠血压及相关活性物质的变化，以期探讨胰岛素抵抗内皮功能障碍与高血压的关系及可能的机制。方法：50只雄性SD大鼠随机分成5组：对照组(C组)及四个实验组：胰岛素组(Ins组)，高糖+胰岛素A组(A组)，高糖+胰岛素B组(B组)，高糖组(Glu组)，每组10只。分别给予不同的处理：C组常规固体饲料，瓶装普通自来水：G1u组常规固体饲料，10％蔗糖水喂养；Ins组常规固体饲料，瓶装普通自来水，另外每日19时皮下注射精蛋白锌胰岛素(上海第一生化药业公司提供)，剂量从每天O．5U／只开始，每日增加0．5u／只至第6天起维持在每天3u／只共注射60天；A，B组除血流动力学检测时间不同外均常规固体饲料，lO％蔗糖水喂养，另外胰岛素处理措施同Ins组。每周固定时间分别用体重仪测量每只大鼠体重，应用电脑大鼠心率血压测量仪测量大鼠收缩压。第5周时对A组及c组5只大鼠处理：将大鼠1 天津医科大学硕士学位论文中文摘要麻醉后分离暴露右颈静脉及左颈动脉，然后经右颈静脉以lug／min输注速度匀速推注Ach，10分钟后再以1．5ug／min的输注速度匀速推注SNP，同时经左颈动脉插管，多导电生理仪描记收缩压演变过程。血压记录完后心脏取血检测血清血糖，NO，GsH及总NoS，s0D活力，血浆Ins，AngII。约8周后对其他各组大鼠同样处理。结果。1．实验过程中各组大鼠同期体重无显著差别(p>O．05)。血压从第三周开始各组之间出现差别，到实验结束，A组，B族，Ins组，G1u组血压分别为154．50±4．65胁眦g，156．70±2．41肼堍，155．33±1．87mlTIHg，155．60±2．59111【r旧g，四者之间没有显著差别(p>0．05)，但均显著高于C组(116．40±6．54mIIlHg，p0．05)，分别为31．73±12．17ⅡmlHgvs．41．41±14．39舰Hg；38．86±8。01lIuIl}lgvs．43。24±13．18mI【IHg；Ins组，Glu组，B组输注AcH和sNP后收缩压下降幅度有显著差别(p0．05)，分别为8．70±2．50咖ol／l，9．85±2．32哪ol／1，8．45±O．95衄ol／1，9．36±3．01哪ol／l，8．06±O．96咖ol／l；Ins组总NoS水平为40．90±2．19U／ml，显著高于其他四组(p<0．05)，但其他四组间无显著差别(p>O．05)，C组，A组，B族，Glu组总NOS分别为33．27±3．55U／ml，32．92±3．06U／ml，33．62±1_89u／ml，32．85±1．81u／ml：NO，s0D水平C组与A组间没有差别，但显著低于Ins组，B组，G1u组(NO：10．51±3．60um01／l， 天津医科大学硕士学位论文中文摘要10．75±2．25umol／lvs15．16±2，91um01／1，17，43±3．44um01／l，17，55±5．5lumol／l，pO．05)；胰岛素水平Ins组和B组分别为214．05±21．95U／L，210。19±13。55U几，显著高于其他组(p<0．05)，但两者间无差别(p>0．05)，Glu组与A组无差别(148．48±9．72u几vs．136．4l±9．55U几，p>O．05)，但四个实验组均显著高于对照组(35．78±7．78U几，p<0．05)：AngII水平B组显著高于其他四组(330．11±27．35pg／m1，pO．05)，分别为155．96±19．55pg／ml，157．45±6．52pg／Ⅲl，140．94±20．“pg／m1，140．77±15．26pg／m1；GSH水平G1u组，Ins组，A，B组分别为567．36±25．05mgGSH几，600．13±49．1lm西sH／L，570．31±29．22IIlgGsH／L，583．60±40．OlmgGsH／L，均显著低于c组(851．19±43．47mgGSH／L，pO．05)．Systolicbloodpr嚣s1|rew踮foundtobesignificannylli曲盱inIns面鼬cdmts，su∞se一捌mts髓dsucmsc_制plusIns．in如sedrats湖paredwimcon细lrats舭Imthethirdweek0n(155．33±1．87皿】Hgvs156．70±2．41mHgvs155．60±2．59I皿Hgvs110．40±6．54咖fIHg，pO．05；38．86±8．01哪nHgvs．43．24±13．18ⅡlrllHg，p>0．05)．Pl踟aglucoselevelwasnotfoundtobesignjficantlyelevatc=d(8．70±2．50胁ol／l，9．36±3．01咖01／1，9．85±2．32哪ol／l。8．45±O．95mm01／l，8．06±O．96嗍ol／l，p>O．05)：tllesemmNO，sOD觚dp1蛐ainsulinl吖e1werefollIldtobesi弘ificalltlyhi曲erinIns-inmsedmts，锄crose—f酣mtsandsucrose_fbdplusms—in如sedratsBcomp鲫甜w曲伍ecoI山∞1rats州O：10．5l±3．60um01／l，lO．75±2．25um01／1vs15．16±2．91umol／1，17．43±3．44llmol／l，17．55±5．51um01／1，p<0．05；SOD：142．82±6．32NU／ml，138．71±4．72NU／mlVS153．80±3．91NU／m1，155．09±2．60NU／ml，150．59±4．76NU／m1，p<0．05)；pl豳mainsulin1cvelwassi印ificamlyhi班erinthecxp“mentalgf01叩scomparedwithtlleconbrolratsr214．05±21．95U／L，210。19±13。55U／L，148．48±9．72U／L，136．41±9．55U几vs．35．78±7．78u／L，pO．05)，至实验结束c组，Ins组，B组，G1u组体重分别为386．90±32．149，422．67±30．939’434．80±31．389，419．90±28．739。说明不同干预对大鼠体重没有影响。结果见表3所示。二．血压变化：1_各组大鼠尾压(收缩压)从实验第三周开始出现差别，至实验结束，Ins组，A，B组，G1u组血压与C组比较均有显著差别(p<0．05；，分别为155．33±1．87肼IHg，154．50±4．65脚l}19，156．70±2．41EⅢfIHg，155．60±2．59眦lHg，110．40±6．54Ⅱ嘣g，显示高糖喂养和(或)注射胰岛素能导致高血压。结果见表4和图1所示。2．EPs电生理仪测量各组血压变化趋势：c组在颈动脉插管稳定后血压平均为122．93±10．96ImIlHg，以1ug／min输注速度匀速推注ACh6分钟，血压平均波动在91．20±21．80ⅡⅡIl}{g，ACh输入结束稳定lO分钟血压平均波动在129．79±13．49Ⅱ删g，以1．5ug／min输注速度匀速推注SNP6分钟血压平均波动在88．38±25．83rrⅢlHg。Ach与sNP处理后血压下降幅度无明显差别(31．73±12．17咖Hgvs．41．41±14．39mfllHg，p>0．05)，显示C组不存在内皮功能障碍，无胰岛素抵抗。Ins组注入Ach与sNP后血压下降幅度有显著差别(33．59±12．51呵Hgvs．58．78±22．24岫腿，pO．05)，而B组注入Ach与SNP后血压下降幅度有显著差别(35．07±8．07mlIlHgvs．46．47±13．09mlIlHg，p<0．05)。结果显示Ins组，B组，Glu组均出现内皮功能障碍，而A组因为时间短暂，并没有出现明显的内皮依赖性血管舒张功能障碍。结果见表5和图2所示。17 天津医科大学硕士学位论文结果三．生化指标1．血清血糖水平C组，Ins组，A组，B组，Glu组血糖浓度分别为8．70±2．50唧01／1，9．36±3．0l衄ol／l，9．85±2．32咖01／l，8．45±0．95咖ol／1，8．06±O．96珊ol／l’五组间没有显著差别(p>O．05)，显示并未达到糖耐量异常及糖尿病状态。各组大鼠血清血糖浓度比较如表6和图3所示。2．血清总NOS活力c组，A组，B组，Glu组大鼠血清总NOS活力分别为33．27±3．55U／ml，32．92±3．06U／ml，33．62±1．89U／ml，32．85±1．81U／ml，四组间没有显著差别(p>O．05)，但Ins组总NoS活力显著高于其他四组(40．90±2．19U／珊l，pO．05)。Ins组，B组，G1u组大鼠血清N0浓度分别为15．16±2．9lumol／1，17．43±3．44llmol／1，17．55±5．51um01／1，三组间无显著差别(p>O．05)，但三者N0浓度分别与C组和A组比较显著升高(p<0．05)。各组大鼠血清N0浓度比较如表6和图5所示。4．血浆胰岛素水平胰岛素水平Ins组和B组分别为214．05±21．95U几，210．19±13．55U几，两者间无显著差别(p>0．05)，G1u组与A组分别为148．48±9．72U几，136．41±9．55U／L，两者间无显著差别(p>0．05)，但四组均显著高于对照组(35．78±7．78U／L，p<0．05)．各组大鼠血浆胰岛素浓度比较如表6和图9所示。5．血清sOD活力c组与A组大鼠血清S∞活力分别为142．82±6．32NU／ml，138．71±4．72N【』／ml，二者间无显著差异(p>O．05)。Ins组，B组，G1u组大鼠血清soD18 天津医科大学硕士学位论文结果浓度分别为153．80±3．9lNU／m1，155．09±2．60Nu／ml，150．59±4．76NU／m1，三组间无显著差别(p>O．05)，但三者SoD活力与c组和A组比较显著升高(p<0．05)。各组大鼠血清SoD活力比较如表6和图4所示。6．血浆AngⅡ浓度C组，A组，Ins组，G1u组大鼠血浆AngII浓度分别为155．96±19．55pg／ml，157．45±6．52pg／ml，140．94±20．44pg／ml，140．77±15．26pg／ml，四组间没有显著差别(p>O．05)；B组血浆AngII浓度为330．1l±27．35pg／m1，显著高于其他四组大鼠(p<0．05)。各组大鼠血浆AngII浓度比较如表6和图7所示。7．血清GSH浓度G1u组，Ins组，A组，B组大鼠血清GsH浓度分别为567．36±25．05mgGSH／L，600．13±49．11mgGSH／L，570．31±29．22mgGSH／L，583．60±40．OlmgGSH／L，四组间没有显著差别(p>O．05)；而c组大鼠血清GsH浓度为851．19±43．47mgGSH／L，显著高于其他四组(pO．05；2，n=10表4各组间每周血压比较(单位：mHg)表4(续)组别第五周第六周第七周C组117．90±5．28112．60±6．17116．40±6．54Ins组152．33±4．36。157．89±4．70’155．33±1．874A组B组154．50±4．654158．10±2．38。159．40±4．744156．70±2．419G1u组151．30±4．90。157．70±4．114155．60±2．594 天津医科大学硕士学位论文结果表5各组大鼠注入Ach和sNP后血压下降比较(单位：IIlⅡlHg)注：}注入Ach和sNP后血压下降没有显著差异，p≥0．05}#使用^ch和sNP后血压下降有显著差异使用SNP后血压下降更加明显，p<0．05表6各组大鼠生化指标结果表6(续)939446527酽66#注l1．·与对照组比较无显著差异，P≥0．05；#与对照组比较有显著差异P<0．05；t与对照组比较有显著差异，但实验组间比较无差异，P<0．052．为减少误差，生化指标每组均选用8只大鼠。21 天津医科大学硕士学位论文结果圈1大鼠每周血压变化趋势图图2各组大鼠使用Ach和SNP后血压变化趋势 天津医科大学硕士学位论文结果<暑日瓣崮迥j吕图3各组血清血糖浓度比较图4各组血清SoD浓度比较ErrOrBar8shOw95．0％ClOfMeanBarsshdwMeans{与对照组比较P≥O．05，#与对照组比较P<0．05ErrorBarsshOw95．0％C1OfMeanBarsshowMeans}与对照组比较P≥0．05，#与对照组比较P0．05)，可能与A组时间短暂，并没有出现明显的内皮依赖性血管舒张功能障碍有关。本研究结果实验组血糖无明显升高，提示未达到糖耐量异常及糖尿病状态，但胰岛素水平，动脉血压及soD水平均显著高于对照，这说明不管胰岛 天津医科大学硕士学位论文讨论素来源如何其诱发高血压及氧负荷具有同样的作用。研究结果也表明不管是否应用胰岛素，葡萄糖喂养大鼠均能导致动脉血压升高及氧负荷增重，这与文献报道也相符，即高胰岛素血症能使大鼠产生高血压⋯““⋯。另外研究结果也显示Ins组及高糖十胰岛素组胰岛素水平显著高于G1u组(P<0．05)，提示动物模型中外源性胰岛素水平高于内源性来源，但SOD水平，N0及血压水平三者并没有显著差异，这可能也说明胰岛素抵抗与高血压的产生与高胰岛素血症有关，而与胰岛素绝对水平无关。胰岛素诱发高血压的机制还包括引起氧化应激呻1。IR状态下，胰岛素能增加NAD(P)H氧化酶活性而促进更多的O：一产生。高血糖除直接增加0f外，代谢产生的晚期糖基化终末化产物消耗NO，促进AcE活性，使ATII产生增加，从而导致内皮功能障碍。经葡萄糖及胰岛素诱发的胰岛素抵抗大鼠模型其主动脉仉一产生及血压升高明显增加，但胰岛素在其中发挥的作用的更大，研究显示高胰岛素不管是否合用葡萄糖处理均比单独应用葡萄糖更能明显增加平滑肌细胞培养中的0i产生。妣daouiadilEl泅3等的实验模型中血糖水平高于对照组，但本研究中血糖水平并无显著升高，仍能导致高血压及氧负荷，这也证明了文章作者的结论：氧化应激及高血压的诱发单独高糖血症是不够的，必须有高胰岛素血症的存在“⋯。四内皮功能障碍性高血压与肾素一血管紧张素系统的关系越来越多的证据显示，高血压与IR状态同时存在““”““。高血压血管功能受损是由血管收缩及舒张因子不平衡所致““。有关文献报道IR是内皮功能障碍的病理因素，它通过产生更多的0f使内皮eNOS活性受损，而Oi的产生与内皮细胞中BH4相对缺乏有关“”。虽然补充BH4能部分地恢复内皮功能，但BH4并不能使IR状态血压恢复正常及恢复氧化负菏““。血管张力的调节除L一精氨酸／NO／cGMP途径外，还依赖于内皮及平滑肌细胞中的各种自分泌及旁分泌系统。其中肾素一血管紧张素系统在IR状态中对血管张力的调节 天津医科大学硕士学位论文讨论具有重要作用。ATII引起的过量超氧阴离子的产生在信号传递及血管张力的调节中具有重要作用叫1。ATII受体有两个亚型，ATl和AT2，ATl受体又分为ATla和ATlbn“。普遍认为ATII在心血管中的己知功能由ATl介导Ⅲ1。shinzaki等‘州通过去除ATla受体大鼠研究ATⅡ受体及NAD(P)H亚单位的表达，来研究ATH在IR中的作用。实验结果显示：ATla受体mRNA表达在果糖喂养大鼠中增加，而ATlb和AT2表达不变；另外NAD(P)H氧化酶每个亚单位的蛋白质表达在果糖喂养大鼠中也增加，而在ATla剔除大鼠中明显下降。这表明IR与ATl受体表达上调及激活NAD(P)H氧化酶活性产生更多的O。一有关。用ATl受体拮抗剂处理能使氧化酶活性正常，改善内皮功能，防止ATII诱发的血管收缩。另外，Rajagopalan“”等指出慢性注射ATII可导致大鼠高血压，同时引起NAD(P)H氧化酶来源的O。’增加，而给大鼠注射洛沙坦则可纠正这些改变。Fukui呻1等报道ATII诱导的高血压NAD(P)H氧化酶活性的增加是通过上调NAD(P)H氧化酶的P22⋯xmRNA水平实现的，而用ATl受体拮抗剂Irbesartan则能使成年sHR大鼠P22”“ml{NA表达及NAD(P)H氧化酶活性正常。所有这些数据均表明肾素一血管紧张素系统在IR诱发的高血压形成过程中是一个病理机制。ATⅡ除了通过G蛋白／ca”一CaM／MLCK(myosinlightchainkinase，肌球蛋白轻链激酶)途径直接引起血管平滑肌收缩外，还能减弱胰岛素敏感性，加重IR。根据动物模型ATII能通过ATl受体相关的JAK2诱导胰岛素受体底物(IRs—1)的酪氨酸磷酸化，这削弱了了胰岛素诱导的与IRs—l相关的P13一K活性，从而减弱胰岛素敏感性，激活蛋白激酶C，丝／酪氨酸蛋白激酶，Akt／蛋白激酶B等，活化姒PK途径。本研究中血浆ATII水平高糖+胰岛素B组显著高于其他四组(P