新型荧光标记试剂的合成与其在高效液相色谱-质谱中的应用

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1、曲阜师范大学硕士学位论文更大的稳定作用，荧光光谱随溶剂的极性增大而向长波方向移动【141。如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，则荧光光谱的波长和强度都会发生很大的改变。在许多兀，7c’态为最低激发单重态或分子内电荷转移型的分子中，溶剂的氢键能力或极性增大，常会使荧光量子产率下降。实际上，对于荧光量子产率随溶剂极性和氢键能力的改变，有些情况下却只随溶剂的极性而改变，但在另一些情况下却与溶剂的氢键能力及极性均有关系。若分子的最低单重态为n，7c’态，但基态时的氢键作用以及最低激发单重态冗，7c’的静电作用，分别提高了最低单重态n，兀’态的能量，而降低了最低单重态兀，兀

2、‘的能量有可能使之成为最低激发单重态，这样便有利于荧光而不利于磷光的产生。因此，在n，兀’态成为最低激发单重态的分子中，处于孤立分子时，溶剂的高极性和高氢键供给能力将有利于荧光的产生。(4)温度的影响温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常随温度的降低，荧光物质的量子产率和荧光强度都增大。在O℃以下温度每降低l℃，荧光量子产率约增加3％。原因是温度对于分子的扩散、活化、分子内部能量转化以及对于溶液中各种平衡均有一定影响。如有荧光猝灭剂的存在，温度对荧光强度的影响就更为复杂。如荧光猝灭剂作用系由于荧光物质分子和猝灭剂分子之间碰撞所引起的，则荧光强度将随温度的升高而降低；如荧光猝灭剂作用系由于

3、荧光物质分子与猝灭剂分子组成化合物，则荧光强度可能随温度的升高而增强。2．1．4荧光试剂的选择某些化合物本身具有较大的共轭体系，在一定波长光的激发下，能够发射荧光。这些化合物可直接用于高效液相色谱分离和荧光检测。但是大多数待测物质没有荧光或者荧光量子产率低，需经衍生化(柱前或柱后荧光标记)才能有效地进行荧光分析。检测方法的灵敏度及色谱分离的选择性与衍生物的性质直接相关。因此用于荧光衍生化反应的衍生化试剂应具备下列条件：(1)在温和的条件下，衍生化反应能方便定量的完成。(2)衍生产物应具有较低极性，以利于有机溶剂萃取并进行分离与浓缩。(3)衍生试剂对某一官能团化合物的衍生反应具有较高的选择性。

4、，(4)过量的衍生试剂易从反应产物中分离或对色谱分离影响较小。(5)衍生产物具有好的色谱分离稳定性。(6)衍生产物具有高的量子效率，发射波长应避开溶剂的背景荧光吸收。(7)试剂应具有较大摩尔吸光度(发光基团应具有最低能量的吸收跃迁)。(8)试剂合成方法简单，原料易得、毒性小。(9)衍生产物在甲醇或乙腈等常用洗脱剂溶液中有足够的溶解度。2．1．5化学衍生法为扩大高效液相色谱技术的应用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍4曲阜师范大学硕士学位论文生法是一个行之有效的手段。化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(化学衍生试剂或标记试剂)与样品组分在色谱分离之前或之后进行化学反应，所得产物

5、有利于色谱分离和检测。高效液相色谱中的化学衍生法分为两类：柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是在分离前，预先将样品转化为衍生物，然后进行分离并检测。柱后衍生则是分离后，在色谱系统中引入衍生试剂和辅助反应液与色谱流出组分在系统中直接进行反应，尔后检测衍生产物。柱前或柱后衍生的主要差别在于前者是根据衍生物的性质不同而进行色谱分离，后者是先对样品混合物分离后再进行衍生及检测。2．1．6常用荧光试剂多年来，为提高检测灵敏度，化学衍生的研究和相应新型衍生试剂的研发一直是色谱领域中最为活跃的研究方向之一。为了满足对痕量和超痕量组分高灵敏检测的要求，30年来已开发研究了多种荧光标记试剂，在应用中各具其特色。表1

6、．1列出了近年来常用的一些荧光衍生化试剂，并附有试剂的应用对象和衍生物的结构式。表1．1荧光衍生试剂及其应用适用的方法＼衍生化试剂衍生物纪舍趴化合物特点1．二甲氨H遏c。‘I矾H2，龟柱前I汛’NH，基萘．5．磺氨基酸，或柱酰(丹酰R．CN，后衍Ar_OH【15J氯，Dns—C1)生柱前邻苯二甲哎：氨基酸，@译或柱醛(OPA)多肽【16】后衍生胃芴甲氧。曰氨基酸【8，17】蝴&柱前羰基氯商衍生(FMOC-C1)N．仅．9．芴～：手性分离氨霉。‰柱前甲氧基碳酰．氨基酸基-N．羧酸基酸【18】衍生酐5曲阜师范大学硕士学位论文柱前芴甲氧碳凡Aa∥小吓叩30H衍酰基甘胺幽a手性分离氨基酸【19】：◎

7、逾H生，酰氯环糊精柱氨基酸(手性皆柱前甲基．9．芴锄分离)【201衍生甲基甲酰哥扎2．(2，3-葸0删c‰柱前基马来酰恻嘞咖RCOOH【211亚胺基)一乙基三氟衍生甲烷磺酸酯对一(9一蒽}≮芦咀研烷基膦酸船邑州厂～多。IPCH3嘛02P-o弋旷GcH；酸)-溴本咖CH2CH3柱前乙酮(CH2)5CH3瞄1嘲衍生、1RSH，R⑨2．氟．4，5-二曳／＼卅砌唧2，—、o、柱前苯基恶唑矿I汛，NH【23】』N沪洲R