雷帕霉素对人骨肉瘤细胞与干细胞中雷帕霉素靶蛋白传导通路的生物学作用与意义

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1、万方数据上海交通大学硕士学位论文雷帕霉素对人骨肉瘤细胞及干细胞中雷帕霉素靶蛋白传导通路的生物学作用及意义摘要目的研究雷帕霉素对人骨肉瘤MG-63细胞和骨肉瘤干样细胞中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）传导通路的影响，探讨雷帕霉素在骨肉瘤联合化疗中的可行性。方法体外培养人骨肉瘤MG-63细胞和骨肉瘤干样细胞，采用免疫荧光技术检测骨肉瘤细胞球中Nanog和Oct4的表达。以0、20、50和100nmol/l浓度的雷帕霉素处理骨肉瘤细胞及骨肉瘤干样细胞观察检测对其的生物学特性影响：采用半定量PCR和定量PCR法检测不同

2、浓度雷帕霉素处理后骨肉瘤干样细胞和未经处理的骨肉瘤细胞中mTOR的表达。细胞存活能力，CCK-8法检测细胞存活和生长。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性CCK-8还原为橙黄色甲臜溶解在培养液中，细胞死亡无法还原CCK-8。酶联免疫检测仪测定橙黄色甲臜吸光度值，可反映活细胞数量。细胞迁移能力，划痕法测定迁移活性，迁移是肿瘤细胞转移过程中不可缺少的环节，肿瘤迁移需要一定运动能力。高转移肿瘤通常具有较强的运动能力。细胞侵蚀能力，细胞侵袭小室法测定其侵蚀能力，恶性肿瘤细胞有局部侵袭作用及远处转移作用，恶性肿瘤

3、首先在原发灶侵袭周围组织然后进入血液循环系统或进入淋巴循环系统出现远处转移。恶性细胞要依赖肿瘤血管形成作用，即肿瘤血管形成作用导致或增强恶性肿瘤生长以及侵袭。细胞成球能力，显微镜观察、摄片、计数、观察经不同方法处理的骨肉瘤干细胞再形成骨肉瘤细胞球的能力，从体外水平阐明mTOR信号通路对维持骨肉瘤干细胞状态的重要性。结果荧光显微镜下可见，骨肉瘤MG-63细胞球较致密的核心部分Nanog和Oct4呈阳性表达，提示成球的骨肉瘤细胞球有干细胞特性。半定量PCR检I万方数据上海交通大学硕士学位论文测结果显示，未经雷

4、帕霉素处理的骨肉瘤干样细胞中mTORmRNA的相对表达量，明显高于人骨肉瘤MG-63细胞（P＜0.05）。定量PCR检测结果显示，100nmol/l雷帕霉素处理组骨肉瘤干样细胞中mTORmRNA的表达量，明显低于0nmol/l雷帕霉素处理组（P＜0.05）。CCK-8法检测结果显示，与0nmol/l雷帕霉素处理组比较，20、50、70和100nmol/l雷帕霉素处理组人骨肉瘤MG-63细胞的增殖均受到明显抑制（均P＜0.05）；20、50和70nmol/l雷帕霉素对骨肉瘤干样细胞的增殖无明显的抑制作用（均

5、P＞0.05），但100nmol/l雷帕霉素对骨肉瘤干样细胞的增殖有明显的抑制作用（P＜0.05）。形态学观察结果显示，雷帕霉素可以有效抑制骨肉瘤干样细胞的成球特性。雷帕霉素处理骨肉瘤细胞后细胞迁移能力明显受限，未经雷帕霉素处理的骨肉瘤干样细胞侵袭能力强于骨肉瘤细胞，70和100nmol/l雷帕霉素处理组骨肉瘤干样细胞可有效抑制细胞侵袭能力。100nmol/l雷帕霉素处理组骨肉瘤干样细胞中OC、ALP、OPN、RUNX2mRNA的表达量，明显高于0nmol/l雷帕霉素处理组（P＜0.05），说明高浓度雷帕

6、霉素对骨肉瘤干样细胞有成骨诱导作用。结论雷帕霉素通过干预mTOR信号途径可以有效抑制骨肉瘤干样细胞的增殖活性、成球特性、细胞迁移侵袭能力，有致细胞凋亡和靶向诱导分化趋势这将为雷帕霉素应用于骨肉瘤联合化疗提供理论依据。关键词：雷帕霉素、骨肉瘤、骨肉瘤干样细胞、雷帕霉素靶蛋白II万方数据上海交通大学硕士学位论文Theosteosarcomacellandtheosteosarcomastemcellcytobiologicalbehaviorinhibitedbyrapamycinthroughthemamm

7、aliantargetofrapamycinsignalingpathwayABSTRACTObjective:ToobservetheeffectofrapamycinontheMG-63osteosarcomacells(OC)andosteosarcomastemcells(OSC)onmTORsignalingpathwayandexplorerapamycinasanoveltherapeuticmethodinosteosarcomachemotherapyregimens.Methods:O

8、CandOSCwereculturedinvitro.ImmunofluorescencewasusedtodetecttheexpressionofNanogandOct4inOCandOSC.OCandOSCweretreatedwithrapamycinindifferentconcentrationsincluding0nmol/l,20nmol/l,50nmol/l,100nmol/l.semi-quantitati