雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究

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1、雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究作者：侯桂琴，鲁照明，穆欣，刘洪涛，刘兰琦，许培荣，薛乐勋，王建人【摘要】　　［目的］研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导通路在食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中的激活状态。［方法］采用细胞免疫组化检测mTOR及其下游靶分子（p70S6K）在两细胞系中的表达，并采用RT-PCR和ethods］TheexpressionofmTORandp70S6Kintouscellcarcinomacelllinesmunocytochemistry;mRNAandprotEinlevels

2、inedbyerasechainreaction(RT-PCR),respectively.［Results］ThereTORinbothcelllines.ThelevelsofmTORandphosphorylatedp70S6KexpressioninEC9706TORsignalingpathouscellcarcinomacelllinesandthestatusofactivationcorrelatestodifferentiationofthecells,i.e.activatedstatusishigherinpoorl

3、ydifferentiatedcellsthanthatins;mammaliantargetofrapamycin;p70S6K;celllines哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）是近年来发现的一种进化上保守的蛋白激酶，参与多种病理和生理过程，是细胞生长的中心调控因子。p70S6激酶（p70S6K）及4E-BP1是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，从而控制含5′-TOP结构的mRNA的翻译。mTOR信号通路在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用，它所介导的信号传导通

4、路的异常与多种恶性肿瘤有关，已成为肿瘤治疗的新靶点[1]。食管鳞癌是我国的常见恶性肿瘤之一[2~4]，但有关食管鳞癌mTOR的研究在国内外尚未见报道。本文拟从RNA及蛋白水平验证mTOR/p70S6K信号通路在食管癌中的存在情况，为从分子水平治疗食管癌打基础。1材料与方法1.1材料抗体及试剂：HRP标记羊抗鼠IgG、S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司；DNALadder分析试剂盒购自碧云天生物公司；mTOR、P70S6K抗体及p-P70S6K抗体购自美国SantCruze公司；反转录试剂盒购自上海生工生物公司；Taq酶

5、和dNTP购自大连宝生物；引物由上海生工生物公司合成。细胞系：高分化食管鳞癌细胞系Eca109由本室保存，低分化食管鳞癌细胞系EC9706由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，阳性对照宫颈癌细胞系HeLa229购自中国科学院上海生物所细胞库。1.2方法细胞培养：三株细胞在含有10%的胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培养液（Gibco公司）中生长，并置于37℃，5%CO2的条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。细胞爬片剂备及免疫细胞化学：将无菌处理的盖玻片均匀铺于六孔板中，接入细胞悬

6、液，过夜培养使细胞达80%融合，吸出培养基，用PBS洗三遍，加入多聚甲醛固定20min，制成细胞爬片，然后按免疫组化试剂盒说明操作。mTOR与p70S6K抗体均1∶100稀释。RT-PCR：Trizol法提取细胞总RNA并进行反转录。设计引物，RT-PCR法分析mTOR及p70S6K的表达。用Gentool进行灰度分析并统计学处理。引物设计如下：mTOR：上游P1:5′CGCTGTCATCCCTTTATCG3′；下游P2：5′ATGCTCAAACACCTCCACC3′，长度为193bp。p70S6K：上游P1:5′TACTTCGGGTAC

7、TTGGTAA3′；下游P2：5′GATGAAGGGATGCTTTACT3′，长度为188bp。4E-BP1:上游P1：5′ACCGGAAATTCCTGATGGAG3′；下游P2：5′CCCGCTTATCTTCTGGGCTA3′，长度为156bp。内参GAPDH:上游P1:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′；下游P2：5′-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3′，长度为570bp。TOR、p70S6K和p-p70S6K表达，蛋白上样量均为50μg。mTOR、p70S6K及p-p70S6K抗体稀释浓度均为1∶200

8、，两种抗均体为1∶5000稀释。mTOR转膜条件为湿转50mA，16h；p70S6K和p-p70S6K转膜条件为半干转22V，100min，加一抗后4℃过夜。次日加二抗，室温下振摇1h，DAB