反义雷帕霉素靶蛋白基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

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1、反义雷帕霉素靶蛋白基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响作者：胡新华张强杨军刘程伟张志深杨德华【摘要】目的：观察以纳米粒子为载体的反义雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法：应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA）包载mTOR基因，制备纳米级粒子混合物。检测其包埋率、体外释放情况及粒子大小。建立自体静脉移植模型，随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组移植静脉转染以纳米粒子为载体的反义mTOR基因，空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体，对照组不予特殊处理。分别于术后3d、7d、14d、28d取材，常规HE、Verhoeff染色，RT

2、PCR、C）凋亡的动态变化。结果：转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少（P＜0.05）；转基因组内膜增生厚度7d、14d、28d较其他组明显减少（P＜0.01）；转基因组凋亡细胞较其他组明显增高（P＜0.05）。结论：纳米粒子可以作为转基因载体，反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生，促进VSMC的凋亡。【关键词】雷帕霉素靶蛋白・基因转移，水平・内皮，血管・静脉・移植，自体・纳米粒子【ABSTRACT】Objective:Tostudytheeffectofan

3、tisensemammaliantargetofrapamycin(mTOR)genetransfectionmediatedbynanoparticles(NP)onneointimalformationinratvEingrafts.Methods:NanoparticleantisensemTORgeneplexined.AutogenousvEIngraftmodelTORgroup:antisensemTORgenemediatedbyNPosis.(2)Emptyvectorgroup:theveinptyvectormediatedbyNP.(3)Controlgr

4、oup(notransfection).ThegraftedveinsTORmRNAandproteinexpressioninedbyRTPCRand光度计，Innova304氩离子激光器（美国Coherent公司）于25±0.1℃，进行激光光散射的测定。纳米粒子表面形态的观察：将包装了pEGPClmTOR质粒DNA的纳米粒子溶于蒸馏水中，滴加于盖玻片上，自然干燥，喷金扫描。1.4载基因纳米粒子体外释放试验称量含pEGPClmTOR质粒DNA的纳米粒子15.5mg,加入TE溶液中制成均一的悬浮液，将其放入双室扩散池的一侧，两池之间用0.22的滤膜隔开，另一侧为接收池，存放等体积

5、新鲜的TE释放液，将此双室扩散池置于37℃130min的恒温摇床中进行释放实验，每24h用新鲜缓冲液更换接收池中的释放液，更换出的样品直接用紫外分光光度计在波长260nm处测定吸光值，计算出释放量绘制累积释放曲线。1.5实验动物分组及局部基因定位转染72只大鼠，随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组：移植静脉转染以纳米粒子为载体的pEGPClmTOR质粒。空载体组：转染纳米粒子包载的pEGPCl空质粒载体。对照组：不予特殊处理。每组24只，分别于术后3d、7d、14d、28d取材。建立大鼠自体静脉移植模型：应用显微外科技术，取颈总静脉内侧支5mm，转基因组将移植静脉段置于已

6、准备好的DNA溶液（称量DNA纳米粒子6mg，加入生理盐水0.3ml，制成均一的悬浮液）中30min后取出静脉，切断同侧颈总动脉，应用110无创缝合线将静脉段端端吻合于同侧颈总动脉；空载体组使用纳米粒子包载的pEGPCl空质粒；对照组使用生理盐水。各组动物分别于规定时间切取移植静脉段，液氮中冻存。1.6形态学研究参照2结果2.1纳米粒子粒度的测定光散射粒度分布图可以看出，制备的载pEGPClmTOR质粒DNA纳米粒子的粒度集中分布在243~343nm，平均粒度为288.9nm。粒径呈窄分布，粒径大小稳定可靠，包封效率为60%，用紫外分光光度计测得DNA含量为3%。粒子的体外释放开

7、始阶段存在爆破释放，约1周后释放量开始稳定，释放曲线缓慢上升，平稳维持释放18d以上（图1）。纳米粒子扫描电镜测定：电镜扫描观察载反义mTOR的纳米粒子，其直径在300nm左右。2.2局部基因转染结果静脉移植1~2周，荧光显微镜下可见有较多转染基因表达，分布于移植静脉中层及内膜，见图2；移植4周，转染基因表达减少。图2荧光显微镜下观察移植血管转染基因的表达（略）2.3形态学研究结果各组均可见移植静脉内膜增厚,以14~28d最为明显。术后3d，对照组及空载体组的内膜增生厚度与转基因