雷帕霉素对人骨肉瘤细胞及干细胞中雷帕霉素靶蛋白传导通路的生物学作用及意义

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1、上海交通大学硕士学位论文雷帕霉素对人骨肉瘤细胞及干细胞中雷帕霉素靶蛋白传导通路的生物学作用及意义硕士研究生：刘沛宜学号：1107529673导师：张伟滨教授申请学位：医学硕士学科：外科学培养单位：上海市伤骨科研究所授予学位单位：上海交通大学万方数据DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterTheosteosarcomacellandtheosteosarcomastemcellcytobiologicalbehaviorinhibite

2、dbyrapamycinthroughthemammaliantargetofrapamycinsignalingpathwayCandidate：LiuPeiyiStudentID:1107529673Supervisor：Prof.ZhangWeibinAcademicDegreeAppliedfor：MasterofMedicalSpeciality：OrthopedicSurgeryAffiliation：ShanghaiInstituteofOrthopedicsandTraumatologyDegree-Conferr

3、ing-Institution：ShanghaiJiaoTongUniversity万方数据万方数据上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日万方数据万方数据上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的

4、规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日万方数据万方数据上海交通大学硕士学位论文雷帕霉素对人骨肉瘤细胞及干细胞中雷帕霉素靶蛋白传导通路的生物学作用及意义摘要目的研究雷帕霉素对人骨肉瘤MG-63细胞和骨肉瘤干样细胞中雷帕

5、霉素靶蛋白（mTOR）传导通路的影响，探讨雷帕霉素在骨肉瘤联合化疗中的可行性。方法体外培养人骨肉瘤MG-63细胞和骨肉瘤干样细胞，采用免疫荧光技术检测骨肉瘤细胞球中Nanog和Oct4的表达。以0、20、50和100nmol/l浓度的雷帕霉素处理骨肉瘤细胞及骨肉瘤干样细胞观察检测对其的生物学特性影响：采用半定量PCR和定量PCR法检测不同浓度雷帕霉素处理后骨肉瘤干样细胞和未经处理的骨肉瘤细胞中mTOR的表达。细胞存活能力，CCK-8法检测细胞存活和生长。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性CCK-8还原为橙黄色甲臜溶解在培养液中

6、，细胞死亡无法还原CCK-8。酶联免疫检测仪测定橙黄色甲臜吸光度值，可反映活细胞数量。细胞迁移能力，划痕法测定迁移活性，迁移是肿瘤细胞转移过程中不可缺少的环节，肿瘤迁移需要一定运动能力。高转移肿瘤通常具有较强的运动能力。细胞侵蚀能力，细胞侵袭小室法测定其侵蚀能力，恶性肿瘤细胞有局部侵袭作用及远处转移作用，恶性肿瘤首先在原发灶侵袭周围组织然后进入血液循环系统或进入淋巴循环系统出现远处转移。恶性细胞要依赖肿瘤血管形成作用，即肿瘤血管形成作用导致或增强恶性肿瘤生长以及侵袭。细胞成球能力，显微镜观察、摄片、计数、观察经不同方法处理的骨肉瘤

7、干细胞再形成骨肉瘤细胞球的能力，从体外水平阐明mTOR信号通路对维持骨肉瘤干细胞状态的重要性。结果荧光显微镜下可见，骨肉瘤MG-63细胞球较致密的核心部分Nanog和Oct4呈阳性表达，提示成球的骨肉瘤细胞球有干细胞特性。半定量PCR检I万方数据上海交通大学硕士学位论文测结果显示，未经雷帕霉素处理的骨肉瘤干样细胞中mTORmRNA的相对表达量，明显高于人骨肉瘤MG-63细胞（P＜0.05）。定量PCR检测结果显示，100nmol/l雷帕霉素处理组骨肉瘤干样细胞中mTORmRNA的表达量，明显低于0nmol/l雷帕霉素处理组（P＜0

8、.05）。CCK-8法检测结果显示，与0nmol/l雷帕霉素处理组比较，20、50、70和100nmol/l雷帕霉素处理组人骨肉瘤MG-63细胞的增殖均受到明显抑制（均P＜0.05）；20、50和70nmol/l雷帕霉素对骨肉瘤干样细胞的增殖无明显