缺氧诱导因子-1α与血管内皮生长因子在宫颈癌细胞表达的低氧调节

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1、缺氧诱导因子一1Ⅱ及血管内皮生长因子在宫颈癌细胞表达的低氧调节硕士研究生：李满超指导教师：韩璐教授专业名称：妇产科学日U吾宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌，在发展中国家则居首位。宫颈癌的发生、发展与多种因素有关，寻找宫颈癌的发病机理是近年来研究的热点。近年来，随着在恶性肿瘤方面的研究不断深入，缺氧是肿瘤组织中的普遍存在的现象，多种不同组织类型的实体瘤组织有严重的组织低氧甚至无氧，此时肿瘤细胞对化学治疗和放射治疗具有抵抗性。HIF—la是迄今为止发现的唯一的特异性缺氧状态下

2、发挥活性的转录因子，在缺氧调节中起着关键作用，是缺氧适应和病理反应中的一个中介因子，是多种血管生长、血流供应、氧化和能量代谢相关基因转录和表达的一个重要调节因子，在缺氧等应激条件下，细胞内的HIF．10【被激活，使细胞、组织和机体产生一系列适应性反应以维持供氧平衡，参与多种肿瘤的恶性转化并促进肿瘤生长。诱导新生血管生成是恶性肿瘤生长、侵袭、转移的前提条件之一，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是最主要的血管生成因子之一，促进内皮细胞生长，并形成新血管，为肿瘤细胞的生长供应营养，升高微血管渗透性，可协助肿瘤细胞进入脉

3、管系统而增加肿瘤转移的几率。在众多调节肿瘤血管形成的因子中，已知缺氧诱导因子(HIF．1Ⅱ)可以在基因水平上直接调控血管内皮生因子VEGF的表达，进而促进肿瘤的生长。肿瘤细胞的过度增生，而相对血管生长不足引起肿瘤组织局部相对缺氧，缺氧又会反馈性的刺激VEGF的表达，促使血管增生，为肿瘤的发展创造条件。本课题旨在通过氯化钴诱导低氧环境，宫颈癌细胞的低氧环境下生长，最后检测低氧诱导因子(HIF．1ct)及血管内皮生长因子(VEGF)瑟静蛋自在富颈癌细臌中表达的研究，探讨悉者与低氧培养时阕之闯的关系，以及两者之间的相关

4、性。为宫颈癌的发病机理研究提供新的思路与方法。为进一步探讨是否可通过阻断HIF，t0l的表达抑制VEGF蛋白产生，从丽达妥治疗富颈瘸的譬麓提供重要鼹莲论依攥。材料和方法一、实验材料1。实验对象及分缀：入富颈痿(Hela)纲憨株(辽宁省农科所大连生物化学研究所)分为缺氧组(氯化钻预处理)2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h及正常氧培养缌。2．主要试剂(1)．兔抗人HIF—la多克隆抗体：武汉博士德生物生物工程有限公嚣。f2)．鼠抗人VEGF抗体多克隆抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司。(3)．S-P超敏试

5、裁盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。f4)．氯化锚：天津科密欧化学试剂公司。为1．DAB：j艺京中衫金撬生甥技术有限公司。(61．SDS．PAGE{k玉分子量标准蛋白戚：上海。3．实验主要仪器设备f11．JY92，II登超声波细胞粉碎视：宁渡薪芝生物科拨股份有限公司。f21。OLYMPUSBX5l全叁动逮徽照攘系统：基本OLYMPUS公司。(31．uvP(CA91786)凝胶成像分析系统：美国GENE公司。(4)，台式商速低滠离心机(5840R)：德国eppendorf。f5、．Jim，XMV．III藿单垂意板电

6、泳檐：大连竞迈生物科技鸯限公司。f6)。Jim．Xps。9型半予式转移电泳仪：大连竞迈生物科技有限公司。(7)．UV一745分光光度计(JJW．3000)：扬州东方集团有限公司。f跣PH240A壅培养籍，于燥稽：土海～恒科李支有限公嗣。二、实验方法l。细胞培养人宫颈癌细胞(Hela细胞)加入含10％热灭活新生牛血清、青霉素!OOU／ml、链霉素lOOU／m!的RPMI1640培养液，然后置于在37。C，湿度100％，5％的C02jfl95％的空气的C02培养箱中孵育培养。待细胞生长呈单层铺满瓶底时，用0．25％的

7、胰蛋白酶(含0．02％EDTA)消化传代。2．低氧培养(氯化钴干预)Hela细胞先更换无血清培养基，然后用氯化钴干预，氯化钴现用现配(取氯化钴粉沫，用无血清培养基溶解)。干预浓度为250¨mol／L，干预终点(2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h)，然后收集细胞，PBS洗3min×2，各检。3．免疫细胞化学染色检测宫颈癌细胞中HIF-IQ和VEGF表达细胞载片的准备：采用干净的盖玻片，将其先置于二甲苯中透明，再用95％酒精浸泡，取出后干净纱布擦净，放于玻璃平皿中高压灭菌，备用。细胞爬片及固定：将浓度为2

8、x106的细胞悬液2m1加入12孔板中，再将处理好的盖玻片放入孔板中，然后置于在37"0，湿度100％，5％的C02平195％的空气的C02培养箱中孵育。镜下观察细胞生长状态，待细胞爬满盖玻片表面的70％．80％时，加入氯化钴进行干预(C02培养箱中)，分别干预2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h，然后将培养基迅速吸出，用冷PBS洗3minx3，用100％的甲醇