血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究

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1、血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究作者：刘琰，杨婉华，马湘一，陈睿，汪蕊，卢运萍，马丁，王世宣【摘要】　　目的研究血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法用基因重组方法构建人反义VEGFR3基因真核表达载体，用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用EM中，置饱和湿度5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。1.2VEGFR3反义核酸载体的构建1.2.1VEGFR3目的基因的制备根据NCBIGenebank登录的VEGFR3的cDNA序列,利用Primer5.0设计VEGFR3胞外1～3区的引物，上游

2、引物设计BamHⅠ酶切位点，下游引物设计EcoRⅠ酶切位点，上游引物序列为：5’GGATCCGACGGCCTGGTGAGTGACTA3’下游引物序列为：5’GAATTCCTTTGAGCCACTCGACGCTGATGA3’。按Trizol说明书从胎盘组织中提取总mRNA(由华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科提供)，再以RTPCR方法大量扩增VEGFR3目的片断。PCR循环条件：94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸45s，共35个循环，全部循环结束后，于72℃做10min终止前延伸。1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物

3、纯化试剂盒纯化目的片断。1.2.2反义VEGFR3重组质粒的构建按常规分子生物学方法，将目的基因和载体连接。连接产物转化，挑取阳性克隆,小量摇菌后酶切初步鉴定、测序。1.3基因转染及细胞分组参考《分子克隆》采用电穿孔转染法，将电击完的细胞转移至已加入适量培养基的35mm培养皿中，培养皿置于含5％CO2的37℃孵箱,24h后观察转染效率。细胞分组：空白组（不做处理的Hela细胞），对照组（转染空质粒pGFPC1的Hela细胞），实验组（转染反义质粒的Hela细胞）。1.4in，封片后荧光显微镜观察。1.5.2流式细胞法检测Hela细胞凋亡率分别收集空白组、对照

4、组和实验组48h后的Hela细胞，常规方法行PI染色后，上机检测。1.6统计分析Hela细胞凋亡率以±s表示，用t检验在SPSS11.5统计软件上分析差异显著性，以P<0.05为有统计学意义。2结果2.1VEGFR3反义表达载体构建及鉴定用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，970bp处有明显扩增条带，其大小与预期目的基因片段相吻合，构建的VEGFR3反义表达载体经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切产生了两条带：载体pEGFPC1片断（4.7kb）和目的片断（970bp）。对酶切正确的质粒进行测序，结果表明其序列与插入方向正确，见图1。1:1kbDNA标准；

5、2:VEGFR3PCR产物（970bp）；3:双酶切产生的条带，可见目的条带（970bp）和载体片断（4.7kb）图1构建质粒的酶切鉴定2.2电穿孔法转染Hela细胞效率的鉴定荧光显微镜下观察，对照组和实验组的Hela细胞可见绿色荧光，通过高倍镜（200×）计数至少3个视野EGFP发光的细胞数与该视野总细胞数的比值来得到基因的转染率，本研究基因转染率约为30％～40％。2.3VEGFR3蛋白的表达APK信号通路，对淋巴管内皮细胞产生特异性的致分裂作用，促使淋巴内皮细胞分裂增殖,促进淋巴管新生[6]。国内外多数研究表明，VEGFC/VEGFR3在肿瘤周边的

6、新生淋巴管内皮细胞呈高表达，与肿瘤的淋巴结转移呈高度相关；VEGFC可通过与VEGFR3结合而促进肿瘤细胞的侵袭和转移，阻断VEGFC或VEGFR3的作用，能够抑制肿瘤的淋巴道转移[79]。VEGFR3在多数肿瘤细胞的表面也有相应的表达,这可能与肿瘤细胞自分泌各种生长因子有关，但其对肿瘤细胞的效应目前尚不清楚。多数研究表明，VEGFR3胞外1～3区为其与配体结合所必需区段，阻断该区的表达，就可抑制VEGFR3和配体的结合，进而阻断其后续的信号传导通路[10]。因此，本实验设计了带有报告基因GFP的VEGFR3胞外1～3区的反义核酸，转染人宫颈癌

7、Hela细胞，转染后的细胞经ustonenT,etal.Expressionofthefmsliketyrosinekinase4genebeesrestrictedtolymphaticendotheliumduringdevelopment[J].ProcNatlAcadSciUSA,1995,92(8):35663570.[2]JoukovV,PajusolaK,KaipainenA,etal.AnovelvascularendothelialgrophaticVesselesasTargetsofTumorTherapy[J].JExpMed,200

8、1,194(6):F37