血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究论文

《血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究论文刘琰，杨婉华，马湘一，陈睿，汪蕊，卢运萍，马丁，王世宣【摘要】目的研究血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法用基因重组方法构建人反义VEGFR3基因真核表达载体.freelega公司；PCR引物购自上海博亚生物技术有限公司；兔抗人VEGFR3多克隆抗体、兔抗人βactin多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG均购自美国SantaCruz公司；ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司。1.1.2细胞培养人宫颈癌细胞株Hela购自美国典型物种保藏中心（AT

2、CC）,培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置饱和湿度5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。1.2VEGFR3反义核酸载体的构建1.2.1VEGFR3目的基因的制备根据NCBIGenebank登录的VEGFR3的cDNA序列,利用Primer5.0设计VEGFR3胞外1～3区的引物，上游引物设计BamHⅠ酶切位点，下游引物设计EcoRⅠ酶切位点，上游引物序列为：5’GGATCCGACGGCCTGGTGAGTGACTA3’下游引物序列为：5’GAATTCCTTTGAGCCACTCGACGCTGATGA3’。按Trizol说明书从胎盘组织

3、中提取总mRNA(由华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科提供)，再以RTPCR方法大量扩增VEGFR3目的片断。PCR循环条件：94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸45s，共35个循环，全部循环结束后，于72℃做10min终止前延伸。1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化试剂盒纯化目的片断。1.2.2反义VEGFR3重组质粒的构建按常规分子生物学方法，将目的基因和载体连接。连接产物转化，挑取阳性克隆,小量摇菌后酶切初步鉴定、测序。1.3基因转染及细胞分组参考《分子克隆》采用电穿孔转染法，将电击完的细胞转移至

4、已加入适量培养基的35mm培养皿中，培养皿置于含5％CO2的37℃孵箱,24h后观察转染效率。细胞分组：空白组（不做处理的Hela细胞），对照组（转染空质粒pGFPC1的Hela细胞），实验组（转染反义质粒的Hela细胞）。1.4APK信号通路，对淋巴管内皮细胞产生特异性的致分裂作用，促使淋巴内皮细胞分裂增殖,促进淋巴管新生6。国内外多数研究表明，VEGFC/VEGFR3在肿瘤周边的新生淋巴管内皮细胞呈高表达，与肿瘤的淋巴结转移呈高度相关；VEGFC可通过与VEGFR3结合而促进肿瘤细胞的侵袭和转移，阻断VEGFC或VEGFR3的作用

5、，能够抑制肿瘤的淋巴道转移79。VEGFR3在多数肿瘤细胞的表面也有相应的表达,这可能与肿瘤细胞自分泌各种生长因子有关，但其对肿瘤细胞的效应目前尚不清楚。多数研究表明，VEGFR3胞外1～3区为其与配体结合所必需区段，阻断该区的表达，就可抑制VEGFR3和配体的结合，进而阻断其后续的信号传导通路10。因此，本实验设计了带有报告基因GFP的VEGFR3胞外1～3区的反义核酸，转染人宫颈癌Hela细胞，转染后的细胞经ustonenT,etal.Expressionofthefmsliketyrosinekinase4genebeesrest

6、rictedtolymphaticendotheliumduringdevelopmentJ.ProcNatlAcadSciUSA,.freelphaticVesselesasTargetsofTumorTherapyJ.JExpMed,2001,194(6):F37F42.4AdhemarLongattoFilho,AlbinoMartins,SandraMariaAraujoCosta,etal.VEGFR3expressioninbreastcancertissueisnotrestrictedtolymphaticvesselsJ.Pa

7、thologyResearchandPractice,2005,201(2):9399.5KlagsbrunM,DAmorePA,VascularendothelialgrophaticendothelialcellstransducergroigratorysignalsviatheVEGFC/DreceptorVEGFR3J.EMBOJ,2001,20(17):47624773.7YulongHe,TerhiKarpanen,KariAlitala.Roleoflymphangiogenicfactorintumormetastasi

8、sJ.BiochimicaBiophysicaActa,2004,1654(1):312.8BronislayGoldm