球状脂联素抑制晚期糖基化终产物及波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡机制的研究

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1、·中文论著摘要·球状脂联素抑制晚期糖基化终产物及波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的机制研究刖舌动脉粥样硬化(AS)是糖尿病主要的血管并发症，而血管并发症是糖尿病致死、致残的主要原因。内皮细胞死伤(凋亡过度)和灶状脱落，血管壁平滑肌细胞及胶原纤维增生(凋亡不足)，形成粥样斑块，造成动脉硬化。内皮细胞凋亡不但使血管内皮防止血脂沉积的屏障作用、局部抗凝和纤溶机制减弱，而且凋亡的内皮细胞具有致凝作用，这些因素造成血管壁局部血栓形成，加速AS发展。因此，防止内皮细胞凋亡具有积极的抗AS作用。糖尿病环境中各种代谢紊乱是诱发内皮细胞结构和功能异常的主要原因。晚期糖基化终产物(AG

2、Es)是糖化、氧化反应的终产物，生成AGEs的基本条件是存在高浓度的葡萄糖。任何原因引起的细胞外葡萄糖浓度的升高均会使暴露于高糖环境中的蛋白质和葡萄糖发生糖化反应，此反应与葡萄糖浓度成正比。蛋白质的氨基和糖的醛基发生缩合反应，首先形成不稳定的schiff碱，再经重组形成相对稳定的氨基酮，即Amadori产物。这两步的反应均为可逆反应，其达到平衡分别需要数小时和数周，此时生成的产物成为早期糖基化产物。早期产物再经缓慢的脱水、环化、氧化及化学重排最终形成不可逆的AGEs。目前研究证实，晚期糖基化终产物(AGEs)在血管壁沉积，AGEs能促使培养的人脐静脉内皮细胞(HIⅣEC

3、s)发生凋亡并增加内皮细胞的促凝活性，可促进AS的形成。在糖尿病患者中，血糖水平经常在一天之内急剧变化。血糖水平不稳定是糖尿病患者治疗过程中出现的一种表现形式，近年的体外细胞培养实验表明波动性高浓度葡萄糖的损伤作用较稳定高浓度葡萄糖者更为明显。血糖不稳定性所引起的生物学效应对糖尿病血管并发症的危险性可能超过绝对高血糖水平。近年来，许多研究表明波动性高血糖相对于持续性高血糖更能促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生与发展。脂联素(adiponectin)被发现是最丰富的脂肪特异的转录物，在血浆中脂联素主要以寡聚形状存在，即一个三聚物、一个六聚物(LMW)和一个42．kDa高分

4、子重量(㈣)的复合物，脂联素的HMW形态比低分子量形态有更强的活性。在人血浆中已经发现脂联素的蛋白酶水解产物，叫做球状脂联素(gAd)，体内实验研究揭示，gAd能够防止动脉硬化，为治疗2型糖尿病和AS可能提供一个新的治疗策略。近来研究揭示，脂联素有抗炎、抗动脉硬化和抗糖尿病等的性质。脂联素被认为是“代谢综合征”的关键分子，是抑制心血管疾病的重要因子。脂联素有两个受体被认识，AdipoRl受体是球蛋白脂联素受体，大量表达在骨骼肌细胞中，AdipoR2是完全长度的脂联素受体，主要表达在肝脏中。在体外，脂联素结合细胞膜上的脂联素受体，激活AMPK通路。治疗胰岛素抵抗、代谢综合

5、征和心血管病可能包括上调血浆脂联素水平，上调内皮细胞脂联素受体或发展脂联素受体激动剂。实验证实，重组脂联素抑制高糖所诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。本研究分别以AGEs和波动性高血糖诱导HUVECs凋亡为模型，探讨gAd干预后对内皮细胞凋亡的影响及其相关机制，为保护内皮细胞，防治糖尿病大血管病开辟新途径。材料与方法一、实验材料1、人脐静脉内皮细胞系CI也一17302、RT-PCR及quantativereal-timert．PCR实验相关试剂3、Western印迹杂交相关试剂4、丫啶橙／碘化丙啶(AO／PI)荧光双染色相关试剂5、MTT比色法相关试剂6、流式细胞仪检测双染标

6、记的细胞凋亡率相关试剂二、实验方法1、HUVECs用RPMI．1640细胞培养基培养。细胞常规在37℃、5％C02、100％湿度的孵箱中培养。细胞每天换液一次，3"-一4d以0．25％的胰蛋白酶消化传代一次。根据实验要求，以不同浓度的细胞接种至培养板中，细胞贴壁24小时后，2用无酚红、无血清、RPMI．1640细胞培养基预处理，即37℃，5％C02中培养24h,使其处于同步化状态。2、体外晚期糖基化终产物(AGEs)的制备：将人血清白蛋白(HSA)0．59和D．葡萄糖3．09溶于0．5mol／LPBS(pH7．4)10ml中，滤膜除菌后37。C恒温避光孵育120天制备A

7、GE修饰的人血清白蛋白(AGE．HSA)。相同条件下，不含D．葡萄糖的孵育液培养的HSA作为对照。经荧光分光光度法鉴定。3、体外培养HUVECs，在不同浓度(100mg／L、200me／L、400mg／L)AGEs作用24h；200medL或400mg／LAGEs作用不同时间以及预处理gAd24h后，再作用24h或48h；分别以相应条件的未修饰HSA作为对照组。4、体外培养HUVECs，对照组(葡萄糖5．5mm01／L)，高糖组(葡萄糖25mmol／L)，葡萄糖交替组(葡萄糖5．5／25n[1Inol／L，每8小时更换培养液一次)，高渗组