enos在高糖诱导rmc中表达及机制的研究

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1、第四军医大学博士学位论文eNOS在高糖诱导的RMC中的表达及机制研究姓名：孟华申请学位级别：博士专业：生理学指导教师：朱妙章20070501缩略语表缩略语英文全称中文全称VEGFvascularendothelialcellgrowthfactor血管内皮生长因子ECendothialcell内皮细胞RMECratcardiacmicrovascularendothelialcells大鼠心肌微血管内皮细胞HUVEChumanumbilicalveinendothelialcells人脐静脉内皮细胞CAMchickenchorioallantoicmembrane鸡胚绒毛尿囊膜N

2、Onitricoxide一氧化氮eNOSendothelialnitricoxidesynthases内皮一氧化氮合酶MCmesangialcell系膜细胞RMCratmesangialcell大鼠系膜细胞BKbradykinin缓激肽DNdiabeticnephropathy糖尿病肾病PKCproteinkinaseC蛋白激酶CERKextracellularsignal-regulatedkinase细胞外信号调节激酶2-DG2-deoxyglucose脱氧葡萄糖Ⅰ独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究

3、成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或

4、其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导师签名：日期：第四军医大学博士学位论文第一部分eNOS在高糖诱导的RMC中的表达及机制研究博士研究生：孟华导师：朱妙章教授第四军医大学生理教研室，西安710032中文摘要研究背景及目的：糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症和致死原因，也是造成慢性肾功能衰竭的常见原因。大约有30％胰岛素依赖型（1型）和5-30%非胰岛素依赖型（2型）糖尿病患者发展成为糖尿病肾脏疾病。在糖尿病肾病的初期是以肾小球滤过率的增加或超滤过为特征，之后逐渐发展成为终末期肾功能衰竭。研究表明，由内皮型一氧化

5、氮合酶（endothelialnitricoxidesynthases，eNOS）和神经元型一氧化氮合酶诱导的一氧化氮(nitricoxide，NO)的产生与糖尿病肾脏的超滤过有关。关于eNOS的表达和NO的产生在肾脏的内皮细胞和上皮细胞已有研究，而在肾小球系膜细胞中的研究至今仍未发现。该实验以大鼠肾小球系膜细胞（ratmesangialcell，RMC）为模型细胞，研究高糖诱导的eNOS的表达和NO的产生。方法：大鼠肾小球系膜细胞（RMC）常规培养在含5.5mM葡萄糖的RPMI1640培养液中，用胰蛋白酶－EDTA混合消化酶传代；用[Ca2+]i显示剂Fura-2AM（1μM）

6、和NO显示剂DAF-2DA（0.5nM）双标记RMC，[Ca2+]i和NO的变化用QM-6荧光计同步测定；用RT、RealTime－PCR和WesternBlot测定eNOS的蛋白和1第四军医大学博士学位论文mRNA相对含量；构建质粒pDsRedeNOS，并建立稳定的转染RMC系，应用激光共聚焦观察记录转染的细胞，用分光光度计测定转染细胞的荧光表达。各项参数均以均数±标准差(Mean±S)表示，采用单因素方差分析,（One-WayANOVA），多重比较采用Dunnettt/TamhanesT2方法。显著性水平α=0.05。结果：在肾小球系膜细胞中，高糖明显增加eNOS的表达(p<

7、0.05)，并有一定的量效、时效关系，同时可促进NO的产生；放线菌酮可以抑制eNOS的蛋白合成；高糖对eNOS的作用不受其磷酸化的影响；PKC和细胞外信号调节激酶抑制剂对eNOS的蛋白合成没有影响；脱氧葡萄糖可以与葡萄糖竞争而抑制eNOS的表达；高糖对eNOS表达的调节与eNOSmRNA的稳定性没有明显关系；高糖明显增加eNOS启动子的活性(p<0.05)。结论：首次检测出eNOS在RMC中的表达，并观察到高糖可以上调eNOSmRNA和蛋白的表达，同时可以促进NO的产生；第一次构