c-Ab1在高糖诱导胚胎神经前体细胞凋亡中的作用及作用机制的研究

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1、山东大学博士学位论文c．Abl在高糖诱导胚胎神经前体细胞凋亡中的作用及作用机制的研究博士研究生：贾德永导师：郝爱军刘凯专业：人体解剖与组织胚胎学中文摘要母体糖尿病能显著增高人类和动物子代先天畸形的风险。神经管畸形(neuraltubedefects，NTDs)是糖尿病妊娠致子代先天畸形中最为严重的畸形之一，同时也是新生儿死亡的主要原因，但糖尿病妊娠致神经管缺陷的分子机理至今仍不清楚。随着糖尿病患病率的增高，神经管畸形的发病率也随之增加，不仅危及患儿的生命和健康，而且给社会和家庭造成沉重的经济负担。为了有效的预防和治疗糖尿病致神经管

2、畸形发生，必须揭示糖尿病妊娠致神经管畸形的发生机理。本研究组及国外一些研究小组的研究发现，高血糖可使发育中的神经上皮过度凋亡，进而导致神经管不能闭合而产生畸形。近年来，氧化应激反应的提出为高血糖致畸机理的研究展示了新思路。提高胚胎组织的氧化应激能力可以减少神经管畸形的发生。有研究显示糖尿病妊娠致畸与高血糖引起胚胎细胞氧化应激而导致神经上皮过度凋亡密切相关。但是，氧化应激是如何引起细胞过度凋亡而产生神经管畸形的，其中的关键分子是什么，至今尚不清楚。近年来本课题组筛选了许多与氧化应激和细胞凋亡相关的基因，c．Abl、Atm和PKC一6

3、等，其中c．Abl更为我们所关注。在高血糖引起的神经上皮凋亡中，c．Abl的作用及其作用机理至今尚未见报道。神经上皮细胞主要由神经前体细胞构成，因此，我们用神经上皮细胞在体外建立高糖诱导神经前体细胞凋亡模型，采用免疫荧光细胞化学、RNA干涉和Westernblot等技术方法，揭示c．Abl在高糖致神经前体细胞凋亡中山东大学博士学位论文的作用及作用机理，从而为高血糖致神经管畸形在基因水平上的机理和防治研究提供了重要的理论支持。一、体外高糖诱导神经前体细胞凋亡模型的建立于小鼠妊娠后12．5天应用体视显微镜成功分离胚胎神经管前端脑泡，经

4、机械吹打获取细胞悬液，接种于无血清培养基，获得神经前体细胞(neuralprogenitorcells，NPCs)。应用5一溴一2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，Brdu)标记以及巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色技术检测其增殖和更新能力，采用神经元特异性抗体微管相关蛋白2(microtubuleassociatedprotein2，MAP2)和神经胶质细胞特异性抗体胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GⅣ心)免疫荧光染色法检测了其分化情况。实验显示，获得的

5、是具有增殖能力和分化潜能的神经前体细胞，可以用于后续实验研究。为了建立体外高糖诱导细胞凋亡模型，实验设定5mM、25mM、45mM、60mM和100mM五组葡萄糖浓度，通过MTT法分析细胞活性。同时，用甘露醇作为对照，排除渗透压对细胞的影响。实验发现，葡萄糖浓度为25mM时细胞的活力最高，这与Maurer等研究者的实验结果一致，说明含25mM葡萄糖的培养基比较适合神经前体细胞的培养。45mM浓度组细胞活性明显低于25mM浓度组，且有显著性差异(氏O．01)。同浓度的甘露醇对细胞活性没有明显的影响。应用(FITC)．conjugat

6、edannexinV方法，检测不同时间段45mM葡萄糖诱导神经前体细胞凋亡的具体情况。结果显示，对照组细胞凋亡率为8％，高糖作用24小时后细胞凋亡率为40％。48小时后凋亡率升至57％，说明45mM葡萄糖浓度能诱导神经前体细胞凋亡，此浓度是高糖诱导神经前体细胞凋亡模型的理想浓度。二、c。Abl在高糖诱导神经前体细胞凋亡中作用的实验研究首先检测c．Abl在高糖诱导神经上皮细胞凋亡中的表达情况。实验分为正常对照组、高糖12h组、高糖24h组和高糖48h组，在mRNA和蛋白水平上，检测c．Abl的表达改变。研究发现，高糖作用12h后c．

7、Abl的mRNA表达开始增加，持续到48h后。而c．Abl的蛋白水平在高糖作用24h(p，o．01)和48h(尸<0．01)时明显高于正常组。c．Abl在不同的亚细胞结构定位具有相应的生物学功能。通过免疫双标定位和核、浆分离的方法，检测高糖情况下c．Abl在细胞内的分布变化。研究发现，高糖作用后，胞浆内c．Abl表达没有明显的改变，而2山东大学博士学位论文胞核的c．Abl水平明显增高，这表明在高糖诱导细胞凋亡时，c．Abl主要在胞核内发挥作用。使用RNA干扰技术抑制c．Abl表达，探讨c—Abl与高糖诱导的细胞凋亡之间的关系。首先

8、设计三组c．Abl的siRNA，确定有效的一组。转染有效的c．AblsiRNA后，Westernblot检测c．Abl蛋白水平，结果显示转染12h后c．Abl的表达出现下降，24hc-Abl的抑制效果最明显，说明转染后24h抑制效果最好。通过MTT