tim-1信号通路在iga肾病大鼠发病机制中的作用

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摘要结论：1.本研究建立以BSA+CCl4+LPS诱导的大鼠IgAN模型，并发现TIM-1mRNA的表达上调，且与IgAN大鼠的24尿蛋白定量，肾脏病理组织学损伤程度正相关，提示TIM-1信号通路可能参与大鼠IgAN的发病及进展。2.IgAN大鼠肾组织中TIM-1与IL-4表达均上调并呈正相关，提示TIM-1信号通路可能参与调控Th2优势反应，而参与IgAN的发病。3.IgAN大鼠肾组织中TIM-1的表达与IFN-γ/IL-4表达呈负相关，提示TIM-1信号通路可能通过调控Th1/Th2平衡来参与IgAN的发病。关键词：IgA肾病；TIM-1；IL-4；IFN-γ；FOXP3IV AbstractABSTRACTObjective:TostudytherelationshipbetweenT-cellimmunoglobulindomainandmucindomain-1(TIM-1)andTcellsubsetsinIgAnephropathy(IgAN)ratsandnormalrats,andtoexploremechanismofTIM-1signalingpathwayactinIgANpathogenesis.Method:1.EstablishexperimentalmodelofIgANrat:20SDmaleratswererandomlydividedintoIgANmodelgroupandnormalcontrolgroup.IgANmodelgroupweresubcutaneouslygivento0.1%bovineserumalbumin(BSA)intragastriceveryotherday+CCL4mixturedwithcastoroilperweek+lipopolysaccharide(LPS)tailveininjectiontwicetoestablisharatmodelofexperimentalIgAN;andnormalcontrolgroupweretreatedwithequalvolumeofPBSandsaline.2.IdentificateIgANratsmodelandobserveindexesduringexperiment:Toobservegeneralconditionsandotherindicatorsofratsincluding24hurinaryprotein,serumalbumin,serumcreatinine.ratswerekilledinthe9thweekendandratskidneywerekeptforHEandimmunofluorescence.partsofthekidneytissuesweregainedforreal-timequantitative,andimmunohistochemicalmethodsforTIM-1、IL-4、IFN-γandFOXP3expression.3.Comparekidneypathologicallesion,immunohistochemicalexpressionandTIM-1mRNAexpressionbetweenthetwogroups.AnalysisTIM-1expressionandclinicalorpathologicaldatainIgANgroup.Result:1.Thegeneralconditionsbetweentwogroups;IgANmodelgrouphadnosignificantdifferencefromcomparisoncontrolgroupatthebeginning.Lackingofexercise,weightgainslowingdownwerehappendedinthe6thweekend,andgotworseinthe8thweekend.Comparedwithcontrastcontrolgroupweightgain,weightgaininIgANratshadbeensignificantlysloweddownsincethe6thweekend,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P<0.01).2.ThekidneypathologyandrenaldamageRatingofrats:V AbstractIgAimmunofluorescenceofnormalcontrolgroupwasnegative,withlightchangeinglomerularandtubularstructure.DifferentdegreesofIgAdepositionalongwithmesangialareaisvisibleinIgANmodelgroup,Andmildtomoderatemesangialwidening,mesangialcellproliferation,interstitialfibrosiswithinflammatorycellinfiltrationcouldbeseenundermicroscopy.RenalpathologicalscoresofIgANmodelgroup(6.30±1.95)wassignificantlyhigherthanthecontrolgroup(1.30±0.82),thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).3.Immunohistochemicalresults:TIM-1poorlyexpressedinrenaltubularcellcytoplasminthecontrolgroup,andgreatlyexpressedinglomerularnucleusandtubularcytoplasminIgANmodelgroup,whichhasasignificantlyhigherquantitativeintegrationthanthecontrolgroupandthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).IL-4poorlyexpressedintherenaltubulescytoplasmincontrolgroup,andgreatlyexpressedinIgANmodelgroup,whichhasasignificantlyhigherquantitativeintegrationthanthecontrolgroupandthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).IFN-γpoorlyexpressedintherenaltubulescytoplasmbothincontrolgroupandIgANmodelgrou,thedifferenceofthequantitativecomparisonwasnotstatisticallysignificant(P>0.05).FOXP3poorlyexpressedinrenalglomerularnucleusbothincontrolgroupandIgANmodelgrou,thedifferenceofthequantitativecomparisonwasnotstatisticallysignificant(P>0.05).4.Real-timefluorescencequantitativemethodtestresultsTIM-1mRNAexpressionofkidneyinIgANmodelgroupwassignificantlyhigherthanthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).5.CorrelationanalysisInIgANmodelgroup,renalTIM1-expressionwaspositivelycorrelatedwith24hurinaryproteinandKatafuchiscore,butnegativelycorrelatedwithserumalbumin,butthere’snostatisticallysignificant(P>0.05).VI AbstractInIgANmodelgroup,renalTIM1-expressionwaspositivelycorrelatedwithIL-4expression,whichwasstatisticallysignificant(P<0.05),renalTIM-1expressionwaspositivelycorrelatedwithrenalexpressionofIFN-γ、IFN-γ/IL-4，andnegativelycorrelatedwithrenalFoxp3expressionwasnotrelevant,butthere’snostatisticallysignificant(P>0.05).Conclusion:1.Inthisstudy,IgANmodelwasinducedbyBSA+CCl4+LPS,renalTIM-1mRNAexpressionwasup-regulatedandpositivelycorrelatedwith24urinaryproteinandIgANratrenalpathologydamagedegree,confirmedTIM-1signalingpathwaywasinvolvedinthepathogenesisandprogressionofIgANrats.2.TIM-1andIL-4inIgANrenalratsup-regulatedandpositivelycorrelatedwitheach,suggestingthatTIM-1signalingpathwaywasinvolvedintheregulation-inducedTh2responseadvantages.3.TIM-1expressioninIgANrenalratswasnegativelycorrelatedwiththatofIFN-γ/IL-4expression,suggestingthatTIM-1signalingpathwaymaybeinvolvedinthepathogenesisofIgANbyregulatingTh1/Th2balance.VII 目录目录第1章引言.................................................................................................................1第2章材料与方法.....................................................................................................32.1材料................................................................................................................32.1.1实验动物.............................................................................................32.1.2主要试剂.............................................................................................32.1.3主要仪器.............................................................................................32.2方法................................................................................................................42.2.1主要溶液配置.....................................................................................42.2.2动物模型的建立、分组及鉴定.........................................................42.2.4苏木素-伊红(hematoxylinandeosin,HE)染色...................................52.2.5IHC法检测小鼠结肠黏膜内TIM-1、IL-4、IFN-γ及Foxp3蛋白的表达...............................................................................................................62.2.6实时荧光定量法（Realtime-PCR,RT-PCR）检测大鼠肾组织中TIM-1mRNA表达.......................................................................................72.3统计学处理..................................................................................................10第3章结果...............................................................................................................113.1两组大鼠一般情况比较..............................................................................113.2两组大鼠24h尿蛋白定量比较..................................................................113.3两组大鼠血生化指标比较..........................................................................123.4两组大鼠肾脏病理比较..............................................................................123.5IHC法检测大鼠肾脏TIM-1、IFN-γ、IL-4、Foxp3的表达....................133.5.1大鼠肾脏TIM-1的表达....................................................................133.5.2大鼠肾脏IFN-γ的表达.....................................................................143.5.3大鼠肾脏IL-4的表达.......................................................................143.5.4大鼠肾脏Foxp3的表达....................................................................153.6RT-PCR检测大鼠两组大鼠肾脏TIM-1mRNA的含量............................16VIII 目录3.7TIM-1表达与各个临床及病理指标间的相关性分析................................17第4章讨论...............................................................................................................204.1实验性IgAN大鼠模型的构建....................................................................204.2IgAN与多种效应性T细胞关系.................................................................204.3TIM-1与肾脏病的关系................................................................................214.4TIM-1与IFN-γ、IL-4、Foxp3的关系.......................................................21第5章结论与展望.................................................................................................235.1结论...............................................................................................................235.2展望...............................................................................................................23致谢.............................................................................................................................24参考文献.....................................................................................................................25攻读学位期间的研究成果.........................................................................................28综述...........................................................................................................................29IX 中英文缩略词表中英文缩略词表缩写英文全称中文全称BSAbovineserumalbumin牛血清蛋白CCL4carbontetrachloride四氯化碳DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺EDTAEthylenediaminetetraacetic乙二胺四乙酸FOXP3ForldaeadboxP3叉状头转录因子3HEHematoxylin-eosin苏木素-伊红IFN-γInterferon-γ干扰素-γIgANIgANephropathyIgA肾病IHCImmunohistochemistry免疫组织化学法IL-4Interleukin-4白细胞介素4LPSlipopolysaccharide脂多糖PBSphosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液RT-PCRrealtimequantitativepolymerasechain实时荧光定量PCRThhelperTcell辅助性T细胞T-cellimmunoglobulindomainandmucinT细胞免疫球蛋白与黏蛋TIM-1domain-1白域基因-1TregRegulatorycell调节性T细胞X 中英文缩略词表XI 第1章引言第1章引言IgAN(IgAnephropathy)指经肾活检证实肾小球系膜区内存在以IgA或以IgA为主的免疫复合物沉积的肾小球疾病，为原发性肾小球疾病中常见，且在全球均有广泛分布。IgAN由BergerJ等[1]在1968年首次报道并认为该病进展缓和，但后来GD'amico等[2]发现超过20％-40％的患者在10至20年内逐渐发展至终末期肾病（ESRD），证实IgAN预后不佳。我国为IgAN高发地区，国内学者[3]回顾性研究13，519例肾活检患者证实4199例（原发性肾病9278例，占45.26％）IgAN的10年肾脏存活率仅为77.1％。目前国际上尚无广泛被认同的IgAN发病机制，其中机体免疫功能障碍，多种细胞因子和炎症介质分泌异常被认为是IgAN发病重要因素。T细胞亚群分化异常在多种自身免疫疾病发病中渐被阐明证实，Th1/Th2失衡与IgAN相关性也已开始受到重视。早在上世纪90年代年Andre等[4]已经检测到大部分IgAN患者肾小球系膜区均有IgAl分子高表达，而过量IgA1需要由成熟B细胞在Th2细胞或病毒抗原的刺激下才能生成。人们还发现自发性产生IgAN的ddY小鼠幼鼠为Thl优势,但成年小鼠却呈现Th2优势、血清IgA水平升高,Nogaki等[5]由此提出Thl/Th2失衡与IgA的分泌水平相关，Th2优势时分泌过量IL-4、IL-6等细胞因子，IL-4和IL-6不仅正反馈Th2过度分化，还同时刺激B细胞活化、增殖，并增加抗体分泌，可能在促进IgAN的发病中占据重要地位。Xiao等[6]发现IgAN较正常人外周血中IFN-γ表达减少,而IL-4比例显著升高,Th1/Th2比值下降并与血IgA水平构成正比，证实了IgAN患者外周血中Th1/Th2失衡向Th2偏倚。近年来，参与自身免疫性疾病的发病的Treg/Th17细胞平衡在IgAN患者向Treg有所偏倚也渐受重视，lin等[7]证实了IgAN肾脏组织中Foxp3表达上调、而致炎因子IL-17A的表达减少，尽管在血清中IL-17A表达有所升高。T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域(T-cellimmunoglobulindomainandmucindomain,TIM)基因家族共同编码具有多种生物活性的I型跨膜糖蛋白，广泛表达并参与多种T细胞介导的各类免疫反应。其中，TIM-1与其天然配体TIM-4特异性结合共刺激T细胞增殖，调节Th1/Th2细胞的平衡[8]。TIM-1分子主要选择性地表达于Th2细胞表面，在SLE患者外周血中观察到TIM-1mRNA表达与Th2细胞因子IL-10呈正相关性增高，而主要表达于Th1细胞的TIM-3在狼疮活1 第1章引言动期仍保持较低表达证实了这点[9]。IdaliF等[10]研究肺结节病患者支气管肺泡灌洗的CD4+T细胞发现TIM-1过度表达上调Th2细胞因子IL-4表达，而不是Th1细胞因子IFN-γ，则证实了TIM-1协同刺激T细胞增殖且诱导Th2优势的免疫反应。TIM-1信号通路还参与Treg和Th17免疫功能调节[11][12]，人们已在体内外实验中发现TIM-1单抗可以限制Th2优势，下调IL-4和IL-10的表达，而显著增加IFN-γ和IL-17表达。学者们还证实了TIM-1单抗干预分别增强食物过敏模型小鼠肠道Treg免疫反应和人类前列腺癌特异性抗原ERG和SIM2的细胞毒性淋巴细胞（CTL）应答[13][14]。综上所述，Th1/Th2和Treg/Th17失衡均参与IgAN发病，而TIM-1信号通路可调控多种T细胞亚群免疫功能，调节T细胞平衡，那么在肾脏组织中TIM-1的表达如何？究竟TIM-1在IgAN的免疫发病机制中如何发挥作用，是否通过调控Th1/Th2、Treg/Th17参与IgAN发病？基于上述背景，本课通过观察IgAN大鼠模型中肾脏组织TIM-1的表达，并分析TIM-1表达与临床指标，Katafuchi评分，IL-4、IFN-γ及FOXP3免疫组化表达半定量积分的相关性，初步探讨TIM-1信号通路与IgAN发病、发展的关系。2 第2章材料与方法第2章材料与方法2.1材料2.1.1实验动物20只5周龄SPF级SD雄性大鼠，体重180-200克，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。2.1.2主要试剂山羊抗大鼠IgA多克隆抗体(ab97184)英国Abcam公司兔抗大鼠TIM1多克隆抗体(ab93646)英国Abcam公司兔抗大鼠IL-4多克隆抗体(ab9811)英国Abcam公司兔抗大鼠IFN-γ多克隆抗体(MBS175177)美国MyBioSource公司小鼠抗大鼠Foxp3单克隆抗体(ab22510)英国Abcam公司PV-6001兔二步法检测试剂盒北京中杉金桥生物制品公司PV-9005小鼠二步法免疫组化试剂盒北京中杉金桥生物制品公司浓缩型DAB试剂盒（ZLI-9032）北京中杉金桥生物制品公司山羊抗兔IgG(H+L)（HS101-01）北京全式金生物技术有限公司PRIMER（A13839）英潍捷基（上海）贸易有限公司First-StrandcDNASynthesis（AE301-02）北京全式金生物技术有限公司SYBR®PremixExTaq™Ⅱ（DRR081A）大连宝生物工程有限公司无水乙醇、异丙醇、PBS缓冲盐、柠檬酸钠盐等为国产分析纯化试剂。2.1.3主要仪器MDF-U281-85℃低温冰箱日本三洋株式会社DNP-9162型电热恒温培养箱北京凯维丰科技发展有限公司ZT-12P生物组织脱水机孝感市亚光医用电子技术有限公司YB-6型生物组织包埋机孝感市亚光医用电子技术有限公司RM-2135型病理切片机德国LEICA公司YT-7FB型生物组织摊片机孝感市亚光医用电子技术有限公司3 第2章材料与方法BH-2型双目光学显微镜日本Olympus公司玻璃匀浆管江苏肯强玻璃仪器有限公司Bio-Rad680酶标仪美国Bio-Rad公司ABIVeriti96孔PCR仪美国Thermo公司ABIStepOneplus荧光定量PCR仪美国Thermo公司低温高速离心机德国Eppendorf公司湘仪——岛津-200型电子分析天平湘仪天平仪器厂2.2方法2.2.1主要溶液配置1．0.01mmol/lPBS缓冲液：在清洁烧杯加入800ml实验用双蒸水和10g0.01mmol/lPBS缓冲盐,以磁力搅拌器搅拌至完全溶解,加双蒸水定容至1L,并调节pH值至7.3,高压蒸气灭菌20min,冷却后4℃冰箱保存备用。2．0.1%BSA溶液：清洁烧杯加入0.01mmol/lPBS缓冲液400ml，称取0.5gBSA加入充分溶解，定容至500ml，4℃冰箱保存备用。3．0.1%DEPC水：DEPC原液1mL以实验用双蒸水定容至1000mL静置过夜，备用。4．1%琼脂糖凝胶清洁干燥小烧杯称取琼脂糖0.3g，加入0.5×TBE电泳缓冲液30mL，微波炉中高火间断煮沸1min至琼脂糖溶化，加入溴化乙啶2μl摇匀后冷却30s，称凝固前倒入制胶板中冷却备用。5．10％中性福尔马林固定液福尔马林100mL+NaH2PO4·2H2O,4.22g+Na2HPO4·12H2O，16.3g，以实验用双蒸水定容至1000mL。2.2.2动物模型的建立、分组及鉴定（1）实验分组：20只SPF级雄性SD大鼠，在实验室适应性饲养一周后，依据体重随机均分为正常对照组和IgAN模型组两个组。（2）实验性IgAN大鼠模型的建立：参照汤颖等[15]的方法使用BSA+CCL4+LPS诱导大鼠发生IgAN，以0.1%BSA溶液隔日灌胃(600mg/kg)9周+25%CCL4蔥麻油混合剂每周末皮下注射(0.4ml/只)，持续9周；并在第6、8周末联合0.05mgLPS尾静脉注射一次，以建立大鼠实验性IgAN模型。正常对照组同时予等4 第2章材料与方法体积PBS溶液灌胃、等体积生理盐水皮下或尾静脉注射。实验期间，参照国家规定的实验动物二级饲养环境标准，保持IgAN大鼠正常的生活环境及正常饮食。（3）IgAN大鼠模型的鉴定：参照汤颖等人[15-16]的IgAN大鼠模型建立要求，以肾脏病理改变为关键标准，即肾组织在光镜下系膜细胞增殖与系膜基质增多，同时伴有IgA免疫荧光在多个肾小球中沿系膜区颗粒状或团块分布。2.2.3一般情况评价及标本的获取和处理(1)从首次灌胃开始，观察和记录IgAN大鼠每日的精神、饮食等一般情况以及体重变化。(2)24h尿液及血液标本留取：造模开始后第1、4、9周末，将单只大鼠置于代谢笼中24小时，采集24h尿液（加入0.3-0.5ml防腐剂，按10ml/1000ml尿液计），计算其24h尿量并检测24小时尿蛋白定量。造模开始后第1、4、9周末，采集大鼠血液2ml检测血肌酐及血白蛋白（第1、4周末使用眶静脉采血法，第9周末使用心脏取血法）。(3)大鼠处死及大鼠肾脏标本留取：大鼠第9周末禁食禁饮1天，10%水合氯醛（3ml/Kg）腹腔注射麻醉后，以橡皮筋固定四肢于手术板上，沿腹白线分层剪开毛皮及肌层，由下至上剪至胸腔，暴露心脏后注射器穿刺取血2ml并送我院检验科化验。大鼠取血后，组织剪暴露游离肾脏组织,依次剪取双肾，并立即用无齿镊剥离肾周包膜、结缔组织,无菌刀片沿冠状面切取单肾皮质，划取部分皮质浸没于4%中性甲醛溶液中，用于苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色；部分皮质OCT包埋后送我院病理科做冰冻切片IgA免疫荧光，另外部分皮质液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于RT-PCR检测。2.2.4苏木素-伊红(hematoxylinandeosin,HE)染色1.取4％中性甲醛固定液（即10%中性福尔马林）固定的大鼠肾皮质(1.5*0.5*0.5cm)，常规脱水、包埋、切片(3μm)、HE染色，HE染色具体步骤如下：（1）脱蜡：玻片置70℃90min，石蜡再次凝固前立即置二甲苯中脱蜡2次，每次10min。（2）水化：梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）清洗掉二甲苯并水化5 第2章材料与方法组织，每次5min，流水3遍冲洗至清亮。（3）染核、分化：苏木素液蓝染细胞核8min，流水洗3次。1％盐酸分化3sec（1％盐酸可清除胞浆的苏木素染色，分化过久可引起核染色浅、脱片），流水洗3次。（4）返蓝、染浆：碳酸锂返蓝2sec，流水洗15min。伊红染细胞浆1min。（返蓝后冲洗要彻底，伊红染色不宜过久）（5）脱水、透明，封片：梯度乙醇（85％5min、95％5min、95％5min、100％5min、100％5min）脱水，、二甲苯I（10min）、二甲苯II(10min)后，（6）风干、封片：置风箱中自然风干4h，中性树胶封片（注意不要产生气泡），镜检。2.肾脏病理损伤评分：观察两组HE染色结果并以Katafuchi评分标准（见表1）对大鼠肾小球、小管间质及血管等参数进行半定量积分评分，进一步评判IgAN大鼠肾脏病理损害。表1Katafuchi评分标准01234肾小球细胞增殖/无＜25％25％-50％＞50％节段损害无＜10％10％-25％25％-50％＞50％球性硬化无＜10％10％-25％25％-50％＞50％间质炎细胞浸润无＜25％25％-50％＞50％/间质纤维化无＜25％25％-50％＞50％/肾小管萎缩无＜25％25％-50％＞50％/血管壁增厚无＜10％10％-25％＞25％/透明样变性无＜25％25％-50％＞50％/2.2.5IHC法检测小鼠结肠黏膜内TIM-1、IL-4、IFN-γ及Foxp3蛋白的表达1.IHC法染色主要步骤如下：（1）包埋、切片：大鼠肾皮质经4%中性甲醛固定液固定24h后，常规脱水、包埋、切片，厚度以2-3µm为宜；（2）脱蜡水化：切片常规烤片脱蜡水化（同上文HE染色），流水冲洗36 第2章材料与方法次至清亮；（3）蒸馏水浸洗3次，3%过氧化氢封闭8min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水浸洗3次；（4）置0.1M柠檬酸钠盐缓冲液中，医用微波炉中高火修复抗原15min钟，待自然冷却；（5）PBS漂洗后以5%BSA封闭，室温孵育10min钟，倾去勿洗，分别滴加一抗(兔抗大鼠TIM-1多克隆抗体1:200稀释，和兔抗大鼠IL-4多克隆抗体1:100稀释，兔抗大鼠IFN-γ多克隆抗体1:200稀释，小鼠抗大鼠Foxp3单克隆抗体1:20稀释)，4℃过夜，阴性对照为PBS代替一抗；（6）滴加辣根过氧化酶标记的二抗工作液，37℃孵育30min（小鼠抗大鼠Foxp3单克隆抗体使用PV-9005免疫组化试剂盒：滴加聚合酶辅助剂(PolyerHelper)工作液，37℃孵育20min；滴加辣根酶标记的二抗工作液，37℃孵育20min；）（8）DAB镜下显色，自来水冲洗15min；（9）苏木素核染1min，流水冲洗3遍，1％盐酸分化3sec，流冲洗3次，碳酸锂返蓝2sec，流水冲洗15min；（10）常规脱水，透明，封片。2.结果判断：观察肾小球和肾小管细胞中TIM-1、IL-4、IFN-γ及Foxp3表达，分别观察细胞染色强度及阳性细胞百分数。TIM-1和Foxp3表达阳性为呈黄染或棕染；IL-4和IFN-γ阳性为胞浆呈黄染或棕染。采用半定量积分法（见表2），每张切片观察5个高倍镜（40X）视野，根据每张切片阳性肾小球、小管细胞比例及着色深浅计分，根据二者计分相乘的分值进行统计分析。表2半定量积分法分值0123阳性细胞比例/〈30％30％～60％>60%着色深浅无色浅黄色棕黄色棕褐色2.2.6实时荧光定量法（Realtime-PCR,RT-PCR）检测大鼠肾组织中TIM-1mRNA表达1．肾组织中总RNA提取（1）将组织从-80℃冰箱中取出，将预先称量的100mg组织放入预冷匀浆7 第2章材料与方法管中，加入lmlTRANZOL研磨匀浆，匀浆置于冰中进行。（2）组织被充分研碎后，转移至0.1%DEPC处理过的EP管，室温静置5分钟后加入氯仿200ul，剧烈摇匀30秒，室温静置5分钟后，4℃12000rpm离心15min分钟，吸取400ul含RNA上清液至另一新的EP管，注意切勿吸取中间层的物质。（3）加入400ul异丙醇，振荡摇匀，室温孵育10分钟4℃12000rpm离心10min分钟后，底部见芝麻大小白色沉淀，弃上清，向EP管内加入75%预备冷乙醇1000ul，移液枪吹打混匀，清洗振荡悬浮沉淀，4℃7500rpm离心5min分钟，再次75%预备冷乙醇1000ul清洗振荡悬浮沉淀，并分装为2管，4℃7500rpm离心5min分钟，一管继续下列步骤，一管直接-80℃保存备用；（4）弃上清，将EP管倒立于滤纸上，空气干燥10分钟至乙醇完全挥发，加入50ul无核酸酶水混匀，进行RNA浓度、纯度及完整性的测定。2.RNA浓度、纯度及完整性的测定2.1RNA浓度的测定取2ulRNA溶液，无核酸酶水作为稀释液空白对照，以紫外分光光度计260nm波长下的光密度值。zkq计算20151222RNA浓度:RNA(ug/ul)=A260光密度值×40×100÷2÷1000，以0.5ug/ul适宜；2.2RNA纯度的测定取2ulRNA溶液，无核酸酶水作为稀释液及空白对照，以紫外分光光度计测定A260/A280值，比值1.8-2.0表明RNA较纯;若比值小于1.8，提示蛋白质污染，若大于2.0，提示乙醇等残留可能；2.3RNA完整性鉴定制备1%琼脂糖凝胶，将凝胶放入加满电泳液的电泳槽中，然后分孔加样含1ul5×RNAloadingbuffer的RNA溶液及RNAMark各6ul，100mv电压下电泳2h或至染料移动至中下3/4处结束。将凝胶移至凝胶扫描成像，观察28S/18S，宽度比值为2:1提示RNA完整性好，若比值降低，逆转或条带模糊，则提示RNA降解。3.引物设计与合成3.1在GenBank中查询得到目的基因（大鼠TIM-1）基因序列，以PRIMER5.0设计引物序列，已排外引物与已知其他基因同源，并以BLAST分析确认引物的8 第2章材料与方法特异性。设定内参基因为β-acting，所有引物均由Invitrogen公司合成，引物序列如下：基因引物序列码TIM-1(forward5′-AGAGTCTGCACCTCCAGTGA-3′primer)(161bp)(reverse5′-CTGTATCCCGTCTGTGAGGC-3′primer)β-acting(forward5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′primer)(209bp)(reverse5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′primer)3.2参照说明书并依据引物分子量，将所需目的基因和内参基因的上下游引物用TE水溶解至100pmol/µl分装冻存于-20℃冰箱，临用前TE水10倍稀释备用。4.两步法RT-PCR反应zkq201512224.1合成cDNA参照cDNA试剂盒（AE301-02,北京全式金）说明书，建立20ul反应体系如下：ComponentsVolumeRNA2μlMixOligo(dT)181μl2×ESReactionMix10μlEasyScriptTMEnzymeMix1μlRNase-freeWater6μlTotal20μl于冰上加样混匀后放入PCR仪，设定反应条件:42℃孵育30min，85℃失活5min。合成的cDNA冻存于-20℃冰箱备用。4.2荧光定量PCR参照PCR试剂盒（DRR081A,大连宝生物）说明书，建立20ul反应体系如下：9 第2章材料与方法ComponentsVolumeSYBR®PremixExTaqTMII（2×）10.0μlPCRForwardPrimer（10μM）0.8μlPCRReversePrimer（10μM）0.8μlROXReferenceDye（50×）0.4μlcDNA2.0μRNase-freeWater6μlTotal20μl于冰上加样混匀离心后放入PCR仪，设定反应条件:95℃30s预变性，PCR反应：95℃5s40个cycles60℃30szkq2015122295℃15s60℃1minmeltcurve95℃15s采用2-△△CT法分析RT-PCR检测结果。2.3统计学处理应用SPSS17.0统计软件对实验结果进行统计分析：计量资料数据以均数±标准差来表示，IgAN模型组和正常对照组间数据比较采用t检验，对IgAN模型组的TIM-1表达与临床、病理资料进行Pearson相关性分析；P<0.05时有统计学意义。10 第3章结果第3章结果3.1两组大鼠一般情况比较大鼠经适应性饲养1周后，体重在160-200g。在开始建立模型后，正常对照组大鼠每周平均体重增长量略大于IgAN模型组大鼠，尤其在第8、9周末期IgAN模型组增长量下降尤其明显，但与正常对照组同时期的增长量相比较，差异无统计学意义（P>0.05）（见表3）。IgAN模型组大鼠皮下注射CCl4后可呈现不同程度的精神萎靡,活动减少，进食减少，这一情况常持续2-3天左右，且在第8周尾静脉注射LPS后尤为明显。模型组大鼠造模过程中未观察到肉眼血尿、泡沫尿或明显尿量减少。两组大鼠实验过程中均未出现大鼠死亡。表3两组大鼠每周平均体重增长量（g/只）1周2周3周4周5周6周7周8周9周n末末末末末末末末末1zkq20151222正常对照组23±1424±1220±820±1318±1418±1518±1118±1218±140IgAN模型121±1322±1521±1721±1418±1118±918±1016±816±9组03.2两组大鼠24h尿蛋白定量比较第1周末两组大鼠24尿蛋白定量变化差异无统计学意义，第4、9周末正常对照组增加仍不明显，而IgAN模型组大鼠24h尿蛋白定量则显著增加，明显高于正常对照组有统计学意义（P<0.01）（见表4）。表4两组大鼠第1、4、9周末24h尿蛋白定量结果比较（mg/24h）n第1周末第4周末第9周末正常对照组103.85±0.544.332±0.494.32±0.50IgAN模型组103.97±0.638.164±0.88*8.74±1.94*T10-0.06-12.09-6.72P100.95<0.01<0.0111 第3章结果与正常对照组同时期相比，*P<0.05。3.3两组大鼠血生化指标比较第1周末两组大鼠血白蛋白无明显下降，差异无统计学意义（P>0.05），而第4、9周末IgAN模型组大鼠血白蛋白较正常对照组则明显下降，差异具备统计学意义（P<0.01）（见表5）。无论是正常对照组还是IgAN模型组大鼠血肌酐均无明显升高，两组间同时期血肌酐相比较差异无统计学意义（P>0.05）（见表6）。表5两组大鼠第1、4、9周末血白蛋白结果比较（g/l）n第1周末第4周末第9周末正常对照组1035.86±1.2635.44±0.9336.22±0.78IgAN模型组1035.43±1.1725.28±0.36*20.94±1.78*T100.2788.8357.734zkq20151222P100.79<0.01<0.01与正常对照组同时期相比，*P<0.01。表6两组大鼠第1、4、9周末血肌酐值结果比较（umol/l）n第1周末第4周末第9周末正常对照组1038.76±8.4339.26±5.6339.25±8.43IgAN模型组1039.70±10.6340.44±11.5142.32±8.673.4两组大鼠肾脏病理比较3.4.1IgAN大鼠第9周末取肾行免疫荧光及HE染色，结果如图3.4.1所示，正常对照组大鼠肾组织IgA免疫荧光为阴性，光镜下可见正常肾小球结构，未见系膜细胞及系膜基质增殖改变，毛细血管襻充盈良好，亦无明显肾间质纤维化、肾小管萎缩等慢性改变；IgAN模型组肾组织IgA免疫荧光则可见不同程度（高倍镜下+~+++）的颗粒状或团块状绿色荧光沿系膜区沉积，光镜下见肾小球弥漫性轻、中度系膜增宽，伴系膜细胞增生，部分增生严重者可见毛细血管襻12 第3章结果受压出现管腔缩窄，还可见系膜细胞增生形成小新月体，肾间质多伴有纤维化及炎细胞浸润，同时还见有肾小管灶状萎缩及血管壁增殖性改变。NAzkq20151222NA图3.4.1(N为正常对照组，A为IgAN模型组)3.4.2每张HE染色切片取任意5个高倍镜（40X）视野，每个视野取任意2个小球和2个小管，IgAN模型组Katafuchi评分显著高于正常对照组，且有统计学意义（P<0.01）（见表7）。表7两组大鼠Katafuchi评分统计对比分组IgAN模型组正常对照组nt值P值Katafuchi评分6.30±1.95*1.30±0.82109.682<0.01与正常对照组相比，*P<0.01。3.5IHC法检测大鼠肾脏TIM-1、IFN-γ、IL-4、Foxp3的表达3.5.1大鼠肾脏TIM-1的表达13 第3章结果如图3.5.1所示，正常对照组仅在肾小管上皮细胞中可见少量TIM-1阳性表达，而IgAN模型组阳性表达较正常对照组显著增多，广泛分布在肾小球胞核和肾小管上皮胞核，定量积分对比差异有统计学意义（P<0.01）（表8）。NA图3.5.1(N为正常对照组，A为IgAN模型组)3.5.2大鼠肾脏IFN-γ的表达如图3.5.2所示，正常对照组和IgAN模型组均可见少量IFN-γ阳性表达，主要分布在肾小管上皮胞核，定量积分对比差异无统计学意义（P>0.05）（表8）AN图3.5.2(N为正常对照组，A为IgAN模型组)3.5.3大鼠肾脏IL-4的表达如图3.5.3所示，正常对照组与IgAN模型组均有IL-4阳性表达，主要分布在肾小管上皮胞浆，且IgAN模型组阳性表达更为显著，且棕染更深，定量积分对比差异有统计学意义（P<0.01）（表8）。14 第3章结果NA图3.5.3(N为正常对照组，A为IgAN模型组)3.5.4大鼠肾脏Foxp3的表达如图3.5.4所示，正常对照和IgAN模型组见少量Foxp3阳性表达，主要分布在肾小球胞核上，定量积分对比差异无统计学意义（P>0.05）（表8）。NA图3.5.4(N为正常对照组，A为IgAN模型组)表8两组大鼠肾脏TIM-1、IFN-γ、IL-4、Foxp3的表达统计正常对照组IgAN模型组nTPTIM-11.0±0.827.5±1.58*10-11.551<0.01IFN-γ2.8±1.032.6±0.97100.5570.59IL-43.4±1.357.5±1.58*10-5.156<0.01Foxp33.0±1.053.2±1.0310-0.4290.68与正常对照组相比，*P<0.01。15 第3章结果3.6RT-PCR检测大鼠两组大鼠肾脏TIM-1mRNA的含量如图3.6所示，扩增曲线图中可见Ct值在第30个cycles左右出现，提示本次PCR扩增效率高，而熔解曲线图中未见明显杂峰，提示RNA样本污染小，本次PCR扩增特异性高。正常对照组和IgAN模型组的ITM-1mRNA的相对表达量分别为（2.03±0.78）和（0.83±0.21），对比差异有统计学意义（P<0.01）（见表9）。图3.6(A为扩增曲线、B为溶解曲线、C为RQ值)表9两组大鼠肾脏TIM-1mRNA相对表达量统计分组NIgAN模型组正常对照组TP相对表达量102.11±0.78*0.83±0.214.532<0.01与正常对照组相比，*P<0.01。16 第3章结果3.7TIM-1表达与各个临床及病理指标间的相关性分析采用双变量Pearson相关性分析法，可见IgAN模型组大鼠肾脏TIM-1mRNA相对表达量与TIM-1半定量积分呈正相关（r=0.481）（见图3.7），分别分析IgAN模型组大鼠肾脏TIM-1mRNA相对表达和24h蛋白尿定量、血白蛋白变化、肾脏病理损伤Katafuchi评分及TIM-1半定量积分和IFN-γ/IL-4半定量积分、Foxp3半定量积分的相关性，结果见图3.7：在IgAN模型组中，TIM-1mRNA相对表达量还与24h尿蛋白的变化呈正相关，而与血白蛋白变化负相关，但不具备统计学意义（P>0.05）（见表10）。TIM-1mRNA相对表达量和肾脏病理Katafuchi评分呈正相关（r=0.846），且有统计学意义（P<0.01）。TIM-1半定量积分与IFN-γ、IL-4半定量积分均呈正相关，与IFN-γ/IL-4呈负相关，仅IL-4相关性有统计学意义（p值分别为P<0.01），与Foxp3则无相关性（r=0.00），且无统计学意义（p>0.05）（见表11）。表10IgAN模型组TIM-1mRNA与24h尿蛋白及血白蛋白相关性分析相关性第1周末第4周末第9周末24h蛋白尿定量Correlation0.390.610.58n=10p.0.260.060.08血白蛋白Correlation0.58-0.55-0.44n=10p0.080.100.20表11IgAN模型组TIM-1与IFN-γ/IL-4、IFN-γ、IL-4及Foxp3半定量积分相关性分析IFN-γ/IL-4FOXP3IFN-γIL-4Correlation-0.070.000.221.00P0.851.000.55<0.01N1010101017 第3章结果ABCDCDCD18 第3章结果EFGH图3.7(A为TIM-1mRNA相对表达量VsTIM-1半定量积分、B为TIM-1mRNA相对表达VsKatafuchi评分、C为TIM-1mRNA相对表达Vs24h蛋白尿定量(第1、4、9周末)、D为TIM-1mRNA相对表达Vs血白蛋白变化(第1、4、9周末)、EFGH分别为TIM-1半定量积分与IFN-γ/IL-4、IL-4、IFN-γ及Foxp3半定量积分的相关性)19 第4章讨论第4章讨论4.1实验性IgAN大鼠模型的构建高效率建立稳定IgAN大鼠模型是进一步研究IgAN发病机制的前提，本研究通过BSA+CCl4+LPS诱导大鼠IgAN模型成功建立。不同于自发性IgAN的ddy小鼠模型，IgAN大鼠模型的诱导机制是通过运用BSA和LPS等免疫佐剂来诱导大鼠产生免疫紊乱，大量IgA从粘膜分泌，而CCl4则可以抑制肝脏对IgA的代谢，以使IgA在大鼠肾脏大量沉积致病。本研究参考不同剂量BSA方案后，于造模过程中运用高剂量BSA(0.6g/Kg)[16],有效缩短建模时间至9周，并取得大鼠IgAN肾脏符合人IgAN的肾脏病理改变特征，满足了实验性IgAN研究要求。在本研究中两组大鼠未出现死亡，正常对照组一般生长情况良好，IgAN模型组在注射CCl4和LPS，尤其是第8、9周可见活动减少，体重增长减缓，全实验过程无明显肉眼血尿表现。IgAN模型组大鼠第1周末无明显蛋白尿增加，至第4周末出现尿中泡沫增多，24h蛋白尿定量增加，且血白蛋白降低。光镜下可见两个组的大鼠肾脏病理中均有炎性细胞浸润，但IgAN模型组显著高于正常对照组，呈广泛分布，且见系膜细胞增殖与系膜基质增多的病理表现，大鼠肾脏IgA免疫荧光可同时见到多个肾小球中沿系膜区分布的绿色荧光颗粒状或荧光团块，基于以上良好肾脏病理和贴近的临床检验室指标，参照汤颖等人[15-16]的IgAN大鼠模型鉴定方法，本研究所建立IgAN大鼠模型较为成功。4.2IgAN与多种效应性T细胞关系过去的研究发现，免疫紊乱是IgAN发病的重要机制之一，T细胞亚群分布、功能紊乱尤为关键[17-18]。Th1/Th2失衡机制参与IgAN发病及进展，Th2优势和IL-4等Th2细胞因子的上调已经得到反复证实[20-21]。IgAN患者血清中IL-4表达上调与IFN-γ表达减少构成Th2偏倚，而在利妥昔单抗治疗后患者蛋白尿和血清IL-4水平下降[22]。在本研究中IgAN大鼠较正常大鼠的肾脏IL-4表达上升，而IFN-γ表达无明显差异，IFN-γ/IL-4与肾脏病理损害评分呈负相关，提示IgAN大鼠肾组织中亦有Th1/Th2失衡，且肾脏Th2偏倚程度与发病进展相关。Treg/Th17平衡在IgAN中的作用也渐受重视，Meng等[23]发现IgAN大鼠肾脏20 第4章讨论CCL20,IL-17A,IL-6和IL-21表达显著升高，认为IgAN肾脏损害是Th17过度活化所致，Watorek等[24]研究也认为IL-17A是IgAN的重要炎性指标。这表明T细胞亚群不仅仅参与调控IgAN发病，也影响着病情进展。本研究中IgAN大鼠肾脏Treg细胞的表达未见变化，Treg/Th17平衡机制在本病有待进一步研究。4.3TIM-1与肾脏病的关系TIM-1由21世纪初McIntire等[25]在研究人类染色体5q23-35基因与哮喘的易感性时首次命名，1998年，Ichimura等[26]又将其命名为肾损伤分子-1（kidneyinjurymolecule-1，KIM-1），因在缺血再灌注大鼠模型中确定该分子的高度表达与肾小管损伤程度相关。KIM-1是人们发现的首个非骨髓源性清道夫受体，由肾小管上皮细胞表达，并参与肾小管中凋亡细胞的吞噬清除和诱导淋巴细胞浸润。KIM-1在近膜端释放出细胞外区并溶于尿液，由于在健康肾脏中几乎不表达，尿液KIM-1联合中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、IL-8、半胱氨酸酶抑制剂Cysc等的检测等可以作为急性肾缺血性损伤（AKI）、慢性肾脏病（CKD）等各类肾损伤的诊断及预后标志。人们在肾小球疾病中，尤其IgAN发病中对TIM-1的研究极少，但Nozaki等[27]发现TIM-1增强新月体性肾小球肾炎T细胞免疫应答，并促进细胞介导的肾脏损害。本研究中同样观察到肾脏TIM-1mRNA的表达上调，与IgAN大鼠的24尿蛋白定量，肾脏病理组织学损伤程度正相关，与血白蛋白呈负相关，但可能因为样本量过小或检验方法的局限性，相关性分析结果无统计学意义，认为TIM-1信号通路一定程度参与大鼠IgAN的发病及进展。4.4TIM-1与IFN-γ、IL-4、Foxp3的关系IFN-γ与IL-4分别是标记Th1、Th2的关键细胞因子，Foxp3则主要由Treg细胞分泌，随着人们近年来加深对T细胞亚群研究，发现TIM-1在SLE、哮喘、IBD等多种疾病中调控Th1/Th2平衡和Treg细胞免疫反应[28],[33]。Ding等[28]通过阻断TIM-1信号通路来促进小鼠免疫耐受，观察到小鼠体内TIM-1主要表达在B细胞发挥免疫功能，并上调IL-4和IL-10的表达，促进Th2应答。但是TIM-1并不仅限于通过B细胞途径调节T细胞免疫，如在Th2为主要免疫应答的过敏性哮喘，TIM-1通过活化T细胞分离的核因子/激活蛋白-1（NFAT/AP-1）转录21 第4章讨论表达来提供共刺激信号，TIM-1还可与TIM-3共同通过肥大细胞来影响T细胞介导的免疫反应，调节Th2细胞因子表达[30-31]。Kim等[32]则认为NKT细胞与TIM1共刺激增强的IL-4的细胞生产，同时抑制产生IFN-γ。正可能是TIM-1信号通路的复杂对Foxp3的表达产生多样影响，如SLE患者血清Foxp3表达下调，而lin等观察到IgAN患者肾脏中Foxp3表达上调[7],[33]。然而在调控Th1/Th2平衡方面，TIM-1明显活化Th2免疫反应，研究证实在Th2优势的过敏性紫癜患者外周血单核细胞TIM-1mRNA的表达有显著上调，并与血清IL-4和IgA1分子水平呈正相关[34]。在本研究观察到IgAN大鼠肾脏TIM-1表达与IL-4表达成正相关，与IFN-γ表达负相关，证实了TIM-1通路可能通过激活Th2优势调控Th1/Th2平衡。本研究还发现肾脏TIM-1表达与Foxp3表达无相关性，认为与样本量过小及肾脏Foxp3免疫组化表达较少有关，故尚不确定TIM-1信号通路是否通过调控Treg细胞免疫应答参与IgAN发病。22 第5章结论第5章结论与展望5.1结论1.本研究建立以BSA+CCl4+LPS诱导的大鼠IgAN模型，并发现TIM-1mRNA的表达上调，且与IgAN大鼠的24尿蛋白定量，肾脏病理组织学损伤程度正相关，提示TIM-1信号通路可能参与大鼠IgAN的发病及进展。2.IgAN大鼠肾组织中TIM-1与IL-4表达均上调并呈正相关，提示TIM-1信号通路可能参与调控Th2优势反应，而参与IgAN的发病。3.IgAN大鼠肾组织中TIM-1的表达与IFN-γ/IL-4表达呈负相关，提示TIM-1信号通路可能通过调控Th1/Th2平衡来参与IgAN的发病。5.2展望近年来，针对IgAN发病免疫机制的研究不断深入，尤其是Th1/Th2失衡在IgAN发病发展中的研究已为人们广泛认可。T细胞亚群分化调节是个多通路、多机制的免疫调节系统，在Th1/Th2失衡的SLE、哮喘等同机制疾病中，TIM信号通路对疾病发病的研究都已经取得一定进展，TIM家族对多种T细胞亚群的调节也逐渐深入，但TIM家族与IgAN发病及进展的相关研究较少，本研究建立IgAN大鼠模型发现TIM-1同样参与IgAN大鼠的Th1/Th2平衡调节，并与疾病病情进展有相关性，提示TIM-1信号通路可能通过调控T细胞亚群参与IgAN发病，下一步可通过阻断TIM-1信号通路来研究其对T细胞亚群表达及IgAN发病影响，进一步探讨、证实TIM-1信号通路在IgAN中的发病机制中的作用。23 致谢致谢首先感谢我的导师王缨教授对我的悉心栽培，王老师不仅仅是在科学研究方面对我进行认真指导，更是在学习、生活和工作中言传身教，给予我无私帮助和教育。王老师严谨、负责的工作态度和宽容、耐心的性情是学生前进道路上的指路明灯。3年前，我半是徘徊、半是迷茫的进入南昌大学医学院进行“八年抗战”，是室友和同窗鼓励我继续进步，是老师和同门指引我不断前行。不曾放弃，终有收获，3年来，在王老师和科室其他各位老师的教导下，稚嫩的我日渐成长。感谢南昌大学第一附属医院肾内科陈钦开教授，周静教授及其他各位老师在临床学习和医疗工作中给予的精心教育，感谢一附院肾内科全体医护人员在我临床学习期间的支持和帮助。感谢师兄汪国平，师妹胡艳萍及师弟郝国军及其他同门在实验过程中给予我许多的帮助。最后，再次衷心感谢我所有的亲人、老师、朋友们，感谢你们在我成长道路上给予我无言的支持和关怀，谢谢！此致敬礼！胡贵荣2015年5月24 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参考文献[33]WangY,MengJ,WangX,etal.ExpressionofhumanTIM-1andTIM-3onlymphocytesfromsystemiclupuserythematosuspatients[J].ScandJImmunol,2008,67(1):63-70.[34]YuanLP,LingL,BoH.Tcellimmunoglobulinandmucin-domaincontainingmolecule1inperipheralbloodmononuclearcellsinHenochSchonleinpurpura[J].IndianPediatr,2012,49(3):225-227.27 攻读学位期间的研究成果攻读学位期间的研究成果已发表论文：1、王缨,胡贵荣,陈钦开等.病例报告淀粉样变肾病伴肾组织内乙肝标志物沉积3例[J].广东医学,2013,34(11):1796.2、王缨,胡贵荣,汪国平等.原发性抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎51例预后分析[J].南昌大学学报（医学版）,2014,(6):57-60.28 综述综述TIM-1、TIM-4分子与T细胞亚群失衡研究进展胡贵荣综述王缨审校摘要：T细胞亚群构成紊乱，尤其是Th1/Th2失衡为IgA肾病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的重要发病机制。TIM基因家族参与介导调节多种T细胞亚群的增殖分化，本文就TIM-1、TIM-4分子与IgA肾病发病相关性的T细胞亚群比例失衡研究进展做一综述。1.TIM基因家族概述21世纪初McIntire等[1]在分析人类染色体5q23-35基因与哮喘的易感性时，在染色体5q33.2上识别出一个基因的主要序列编码完全背离了控制气道高反应性的TAPR调节器，且与人类甲肝病毒（HAV）受体同源，首次将其命名为TIM-1。TIM家族在小鼠有8个基因（TIM-1至TIM-8），其中TIM-5至TIM-8为有待证实序列的预测基因，在人类发现有3个：TIM-1(Havcrl)、TIM-3(Havcr2)、TIM-4[2]。小鼠和人类TIM基因编码区分别位于染色体11b1.1和5q33.2上，这两处染色体区在人类基因图谱中被证实为与过敏性和自身免疫性疾病易感性相关，中国地区的儿童哮喘、类风湿性关节炎等的发病有可能也同TIM-1、TIM-3、TIM-4的基因多态性存在一定联系[3]。T细胞免疫球蛋白粘蛋白（TIM）基因家族编码的跨膜糖蛋白具有多种生物活性，各自表达于T淋巴细胞、APC等不同细胞表面，主要参与调节T辅助细胞介导的各种免疫反应，其中，TIM-1与其天然配体TIM-4特异性结合，共刺激T细胞增殖，可调节多种效应性T细胞的表达，影响Th1/Th2细胞的平衡[4]，而Th1/Th2失衡，Th0分化向Th2偏倚，被认为是IgA肾病(IgAnephropathy，IgAN)，系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病和变态反应疾病的发病重要机制[5]。2.TIM1、TIM4的表达2.1TIM-1在肝、肾、脾、肺组织均有表达，TIM-4则主要高表达于淋巴器官。29 综述1998年Feigelstock等[6]以从非洲绿猴肾脏细胞中分离得到的甲型肝炎病毒细胞受体-1（HAVcr-1）为特异性引物，通过RT-PCR从人类肝脏组织的mRNA扩增出huHavcr-1，对比分析HAVcr-1和huHavcr-1的359个氨基酸序列证实存在79％的同源性。1998年，Ichimura等[7]在缺血再灌注大鼠模型中，发现膜蛋白分子可以分泌于肾脏的近曲小管上皮细胞顶端膜上，并确定该分子的高度表达与肾小管损伤程度相关，将其命名为肾损伤分子-1（kidneyinjurymolecule-1，KIM-1）。Xu等[8]在哮喘小鼠肺组织也发现有TIM-1mRNA表达，而且流式分析小鼠脾组织TIM-1表达显著升高。同源性分析还发现TIM-1与大鼠KIM-1有78%同源性，与人类HAVCR-1则有42%同源性。不同于TIM-1在人体组织中的广泛表达，TIM-4在人组织表达分布主要是集中于脾脏及淋巴结等淋巴器官。Shakhovl等[9]在Lα和Lβ淋巴毒素基因敲除小鼠的脾脏中确定了TIM-4基因的存在，原位杂交脾脏切片证实SMUCKLER的表达主要在脾脏边缘区，并称为SMUCKLER（spleen,mucin-containing,knockoutoflymphotoxin；脾，含粘蛋白，淋巴毒素的基因敲除）。NorimotoKobayashi等[10]认为淋巴器官中尤其是扁桃体、脾脏TIM-4mRNA的表达最高，在肾、肝、肺及外周血中仅表达很少的TIM-4mRNA。2.2TIM-1选择性表达于Th2细胞，TIM-4限制性表达于APC。TIM-1分子选择性地表达在活化的CD4+T细胞表面尤其是Th2细胞表面，在Th1细胞表达较低。在SLE患者外周血中，Th2细胞因子IL-10与TIM-1mRNA表达呈正相关性增高，SLE活动期患者的TIM-1mRNA表达水平升高尤为突出，而TIM-3mRNA则始终都表达在正常水平[11]。FarahIdali[12]的研究也证实了这一点，在肺结节病患者CD4+、CD8+细胞上，TIM-1和TIM-3均有表达，而非Lofgren综合征患者相比于Lofgren综合征患者TIM-1表达水平较低，但有更高的IFN-γ和TIM-3表达，这表明在Th1反应更强的Lofgren综合征患者并未出现TIM-1表达的升高，提示TIM-1可表达于多种活化T细胞，且Th1细胞并非其主要表达细胞。可见，TIM-3主要表达于Th1细胞，而TIM-1相对的主要表达于Th2细胞。TIM-4限制性表达于成熟的抗原提呈细胞表面，包括成熟B细胞，髓系、淋巴系树突状细胞（CD11c）以及巨噬细胞（CD11b），而在T细胞（CD4+、CD8+）尚未见表达。LeeA.Albacker等[13]证实BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞（PMφs）30 综述表达高水平的TIM-4，但脾脏CD19+B细胞和静止或活化的T细胞没有检测到有TIM-4的表达。Rodriguez-Manzanet等[14]从SJL/J小鼠骨髓中分离纯化出CD11c+和CD11b+细胞后，以fms-样酪氨酸激酶-3和脂多糖孵育，流式检测发现这些活化的树突状细胞（DCs）TIM-4表达水平上调，统计表明TIM-4在CD11c+CD11b+细胞亚群表达最高，CD11c-CD11b+细胞也有少量表达，而CD4+、CD8+或CD19+（B细胞）均未见TIM-4表达，这也证明TIM-4mRNA表达水平在人髓系DC的标志性细胞CD11c+中最高。他们将SJL/J鼠脾细胞中分离纯化出的CDllb+、B220+及CD3+三种细胞，进行单独体外培养时均无增殖现象，而TIM4-Ig处理后单独培养的CD3+细胞或混合有CDllb+、B220+任意一种APC细胞的混合培养的CD3+细胞均可发生较高的细胞增殖。人们在骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和局部炎症组织内的巨噬细胞都也有TIM-4的表达，Zhao等[15]RT-PCR定量证实SLE患者外周血单核细胞有较高TIM-4mRNA表达水平，而且TIM-4mRNA表达水平与SLE活动有明显相关性。3.TIM-1、TIM-4结构TIM基因家族是一种I型跨膜糖蛋白，TIM家族编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白具有共同基序和相似基础结构，它们的分子共同结构包含有一个胞外结构域，一个跨膜区和一个细胞质域[16]。胞外结构域IgV区主要结构为4个高度保守的半胱氨酸结构，各TIM基因Ig结构域的氨基酸序列共同性达40-60％。TIM-4的疏水性FG环、特性CC'环和金属离子依赖性的配体结合位点也存在于该结构区域，粘蛋白结构域存在较大的长度差异，其中TIM-4的粘蛋白样结构域因富含多个氨基酸序列而最长。胞外结构域中的高度糖基化的黏蛋白样结构域紧跟于免疫球蛋白结构域的N-端末位是该家庭成员区别于其他T细胞共刺激分子的结构特征，但类似其他共刺激分子的是，除TIM-4外的TIM分子在胞质域均可见参与配体结合信号转导的酪氨酸磷酸化基序。TIM-4的短胞内尾区结构不含磷酸化位点，但是TIM-4IgV区的特有疏水性FG环和CC'环间存在的金属离子依赖性的配体结合位点，甚至还能识别凋亡小体表面的磷脂酰丝氨酸（PS），吞噬凋亡小体[17]。4.1TIM-1、TIM-4的免疫调节功能31 综述4.1TIM-4是TIM-1的天然配体，TIM-1-TIM-4相互作用共刺激活化T细胞增殖。TIM家族是调节T细胞增殖的重要共刺激分子，胞外结构域含有IgV和大量糖基化的黏蛋白是该家庭成员区别于其他共刺激分子的结构特征，故不同于其他协同刺激分子需要与受体CD28或CTLA-4结合形成协同刺激信号，TIM蛋白与配体结合中的信号转导主要由胞质域的酪氨酸磷酸化基序参与（TIM-4除外）。胞内区共同基序与配体交联诱导活化连接蛋白（LAT)的磷酸化，LAT的磷酸化可以激活ERK／MAPK途径，上调T细胞Bcl-2的表达，细胞分裂和抗凋亡信号共同作用，最终完成TIM信号通路对活化CD4+T细胞的信号转导。JenniferHarttMeyers等[18]研究TIM-4-Ig融合蛋白介导的CD3和CD28共刺激的脾脏活化T淋巴细胞增殖，发现这一增殖可被TIM-1抗体阻断，标记的TIM-4Ig融合蛋白在活化T细胞表面高表达的TIM-1被封闭时，根本无法识别结合T细胞，而且小鼠体内研究证实TIM-1-Ig融合蛋白或TIM-4-Ig融合蛋白均可以单独刺激T细胞的大量增殖，提示TIM-4虽限制性表达于成熟的APCs，但是TIM-4可以结合TIM-1参与调节T细胞的活化增殖。然而，TIM-4的与T细胞关系远比此复杂，Mizui等[19]用TIM-4可溶性蛋白处理体外培养的T细胞时细胞增殖出现双向调节效应，T细胞增殖仅发生于高剂量，低剂量反而呈抑制效应。他们认为这一结果并不驳斥TIM-1与TIM-4共刺激T细胞增殖的相互作用，但却进一步表明对TIM-4可能参与调节T细胞发育的多个环节，因为初始T细胞表面的非TIM-1分子可与活化T细胞表面的TIM-1分子竞争性结合TIM-4抑制初始T细胞的活化。Xiao等[20]在抑制CD4+T细胞增殖和IL-2的分泌的TIM-4-Fc中，证实了TIM-4抑制T细胞增殖作用必须有胞外IgV区和粘蛋白样区的参与，而胞外结构域中特有的金属离子依赖性非TIM-1配体结合位点，则被认为是表面磷脂酰丝氨酸受体的独有识别点。4.2Kim-1赋予肾小管上皮细胞吞噬功能，TIM-4调节巨噬细胞对凋亡细胞吞噬。肾脏损伤分子-1(KIM-1)是人们发现的首个非骨髓源性清道夫受体，由肾损伤的上皮细胞表达，并参与肾小管中凋亡细胞的吞噬清除和诱导淋巴细胞浸润。TakaharuIchimura等[7]进一步研究了表达KIM-1的肾小管上皮细胞的类巨噬细胞样吞噬作用，他们认为，KIM-1胞外区结构特异性结合坏死上皮细胞膜表面32 综述暴露的磷脂酰丝氨酸PS和OX-LDL结构，是KIM-1介导肾小管上皮细胞吞噬清除凋亡坏死细胞的主要作用机制。KIM-1在近膜端释放出细胞外区，并可溶解于尿液，由于在健康肾脏中几乎不表达，尿液KIM-1联合中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、IL-8、半胱氨酸酶抑制剂Cysc等的检测等可以作为急性肾缺血性损伤（AKI）、慢性肾脏病等各类肾损伤诊断及预后的敏感生物标志。TIM-4参与巨噬细胞对凋亡细胞的识别结合，介导调节巨噬细胞的吞噬功能。凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸抗原决定簇PS可被TIM-4上CC’和FG’环形成的凹槽特异性地识别，TIM-4IgV区金属离子依赖性结合位点可识别并结合凋亡细胞表面曝露的PS。Santiago等[17]研究TIM-4抗体在体内外实验中对巨噬细胞的影响差异,发现体外共孵育的腹腔巨噬细胞与凋亡的胸腺细胞经TIM-4抗体预处理后，被腹腔巨噬细胞吞噬的凋亡胸腺细胞数量减少，而小鼠动物实验中以TIM-4mAb处理后，标记的凋亡胸腺细胞清除速度下降，两者都提示TIM-4是巨噬细胞识别和吞噬凋亡细胞的受体，阻断TIM-4可抑制巨噬细胞吞噬凋亡细胞的功能。4.3TIM-1、TIM-4多样性调节多种效应性T细胞及其细胞因子的表达。4.3.1TIM-1、TIM-4与辅助性T细胞的关系TIM-1与TIM-4相结合共刺激T细胞增殖，主要诱导Th2细胞分化及其细胞因子的表达，也条件性的部分上调Th1及Th17的表达。Umetsu等[21]观察到以TIM-1单克隆抗体（3B3）预处理体外培养的CD3和CD28时，T细胞发生增殖，Th2细胞因子的表达上调，而Th1细胞因子的表达无明显变化；但在体内实验，即使是在没有的抗原刺激，TIM-1单克隆抗体也可以显著增加T细胞增殖，且Th1和Th2细胞因子表达同时上调，并以Th2细胞上调为主。ShengXiao等[22]在TIM-1与3B3交联调节体外培养的CD4+T细胞Th细胞因子分泌的研究中，发现无论树突状细胞存在与否、TIM-1抗体浓度高低，CD4+T细胞上IL-4和IL-10的表达都会增加，而IFN-γ和IL-17表达显著改变只发生于高浓度的TIM-1抗体、树突状细胞存在时，也证实了TIM-1主要促进Th2应答，Th1和Th17细胞反应增强则有条件限制。YujiNozaki等[23]以TIM-1抗体干预新月体性肾小球肾炎模型小鼠，结果CD4+T细胞亚群Th1和Th17分化减少，脾脏T细胞IFN-γ和IL-17A33 综述表达下调，而Th2细胞、Treg及其细胞因子IL-4、Foxp3在全身的表达并无减少。Th2细胞分化增殖是TIM-1与TIM-4二者结合共同作用的结果，不可或缺，因此即可被TIM-1抗体阻断，也可被TIM-4抗体阻断。Liu等[24]观察了金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）预处理的人类DC与初始CD4+T细胞共培养诱导的Th2反应，他们认为SEB通过Toll样受体2（TLR2）和核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）通路上调T细胞TIM-4表达，与TIM-1结合诱导Th2极化，参与过敏性疾病的发病，且这一发病过程可被TLR2、NOD1、TIM-4或TIM-1任一对应抗体可阻断。Xu等[25]认为Blag7（德国小蠊源性泛过敏源）所致过敏中Th细胞的分化调节受树突状细胞的影响，人类树突状细胞与CD4+T细胞共培养时其IL-4的表达增加，而IFN-γ表达下降，这表明从Th1细胞平衡转向Th2型，抗TIM-4可逆转IL-4+/IFN-γ+比例的提高，并减少IL-13的释放。4.3.2TIM-1、TIM-4与调节性T细胞的关系NicolasDegauque等[26]认为活化的CD4+Foxp3+T细胞经TIM-1单抗处理，下调其转录和蛋白水平的Foxp3表达，且在小鼠移植耐受模型中阻断TIM-1可以有效错编Tregs，干扰Tregs对T细胞反应的抑制性调控，进而阻止移植耐受。Wang等[27]证实在食物过敏小鼠模型中TIM-1还与天然配体TIM-4相互作用减弱口服免疫耐受，诱导肠道过敏反应，以TIM-1或TIM-4抗体干预食物过敏小鼠模型可见空肠及脾脏Foxp3mRNA表达上调，调节性T细胞在防止肠道过敏性反应中起重要作用，可减轻肠道组织过敏反应损伤。4.3.3TIM-1、TIM-4与细胞毒性T细胞的关系Arredouani等[28]认为TIM-1分子参与淋巴细胞和树突状细胞的成熟分化，由此推测并证实了TIM-1单克隆抗体可以增强人类前列腺癌特异性抗原ERG和SIM2的细胞毒性淋巴细胞（CTL）应答。Baghdadi等[29]则发现TIM-4可直接与AMPKα1交互，激活自噬介导的肿瘤细胞自降解，降低抗原提呈和CTL反应。他们通过阻断TIM-4-AMPKα-1-自噬信号通路，增强肿瘤特异性CTL应答，显著提高癌症化疗诱导的抗肿瘤效果。5.IgAN与多种效应性T细胞关系34 综述T细胞亚群的分布紊乱，尤其Th1/Th2细胞比例失衡是IgAN发病和进展的重要机制。Xiao等[30]采用流式细胞仪检测IgAN患者外周血CD3+T细胞IFN-γ、IL-4、TGF-β1表达,结果IgAN组较正常对照组外周血中Th1细胞比例减少,而Th2、Th3细胞比例均显著升高,Th1/Th2细胞比值下降,与血清IgA水平成正比，证实IgAN患者外周血中Th1/Th2失衡向Th2偏倚，参与IgAN发病。Peng等[31]以ELISA检测IgAN患者血浆也提示IL-22和IL-17水平较正常人升高，表明Th22细胞和Th17细胞参与IgAN的免疫应答。Treg细胞抑主要通过接触性抑制机制或分泌细胞因子TGF-β抑制CD4+和CD8+T细胞的活化、增殖，进而发挥其免疫抑制作用，近年来，Treg/Th17细胞平衡参与自身免疫性疾病的发病渐受重视。Miyamoto等[32]以木菠萝凝集素处理抗CD3、Th2共培养的正常人外周血单核细胞后，单核细胞产生的Treg细胞在效应性T细胞中比例上调60倍，他们认为调节性T细胞的增加可以抑制Th2细胞刺激B细胞产生IgA，有利于控制IgAN病情进展。lin等[33]在IgAN患者发现肾组织上调Foxp3、下调IL-17A的表达，Treg/Th17平衡在IgAN患者有所偏倚。但ELISA检测血清IL-17A的表达升高，相比较发现29例无IL-17A表达的患者，肾功能更差，尿蛋白更多，肾小管间质损害更严重。Tc细胞也被认为以其特有信号通路一定程度的参与IgAN发病，Gorgi等[34]认为突尼斯人IgAN易感性似乎是与CTLA-4和fas/fasl基因多态性的存在相关联，Fas/FasL途径介导靶细胞的凋亡，是近年来人们发现不依赖于释放穿孔素-颗粒酶途径的另一Tc细胞机制。王等[35]将IgAN患者的血清分子层析出聚合体IgA1(aIgA1)与足细胞共培养，发现aIgA1可诱导足细胞的凋亡,相比较于健康对照，IgAN患者来源的aIgA1诱导足细胞FasmRNA升高2.4倍。6．结语近年来，TIM家族在体外细胞培养和多种自身免疫性疾病、恶性肿瘤、过敏性疾病等动物模型的研究都已经取得一定进展，TIM家族对多种T细胞亚群的调节也逐渐深入，但TIM家族与IgAN发病发展的相关研究较少，IgANTh1/Th2失衡与TIM家族的关系仍需进一步研究。参考文献[1]McintireJJ,UmetsuSE,AkbariO,etal.IdentificationofTapr(anairwayhyperreactivityregulatorylocus)andthelinkedTimgenefamily[J].NatImmunol,2001,2(12):1109-16.35 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