ARAP1_AT1R信号通路在糖尿病肾病发病机制中的作用及干预研究

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分类号：R692单位代码：10159密级：公开学号：201520200硕士学位论文（临床医学硕士学术学位）中文题目：ARAP1/AT1R信号通路在糖尿病肾病发病机制中的作用及干预研究英文题目：ARAP1/AT1Rsignalingpathwayindiabeticnephropathytheroleofpathogenesisandinterventionresearch论文作者：鲁伶旭指导教师：范秋灵教授学科专业：内科学（肾内科）完成时间：2018年3月I 中国医科大学硕士学位论文ARAP1/AT1R信号通路在糖尿病肾病发病机制中的作用及干预研究ARAP1/AT1Rsignalingpathwayindiabeticnephropathytheroleofpathogenesisandinterventionresearch论文作者鲁伶旭指导教师范秋灵申请学位医学硕士培养单位附属第一医院一级学科内科学二级学科肾内科研究方向糖尿病肾病论文起止时间2016年10月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月I 中国医科大学硕士学位论文摘要目的：探讨2型糖尿病db/db小鼠及体外高糖培养肾小球的系膜细胞中，ARAP1的表达变化及与AT1R的相互调控作用，是否引起系膜细胞增殖，细胞外基质积聚，氧化应激亢进，从而导致糖尿病肾病的损伤。以及观察乌索酸对2型糖尿病db/db小鼠的肾脏保护作用以及对ARAP1和AT1R的表达的影响。研究方法：9周龄db/db小鼠（BKS.Cg-leprdb/leprdb）按照空腹体重随机分为糖尿病肾病组（db/db组，n=10）和乌索酸治疗组（db/db+0.3%UA，n=10）。同周龄db/m小鼠（BKS.Cg-leprdb/+，n=10）作为对照组。每周检测各组小鼠体重；定期检测血糖；于20周龄随机的留取尿液测定尿白蛋白/尿肌酐比率。光镜下观察肾组织的病理改变；免疫组化检测肾组织内的血管紧张素II1型受体相关蛋白（ARAP1）、血管紧张素II1型受体（AT1R）、细胞外基质蛋白纤维连接蛋白（FN）的表达变化。实时定量PCR法检测血管紧张素II1型受体相关蛋白（ARAP1）、血管紧张素II1型受体（AT1R）、NADPH氧化酶4（NOX4）、NADPH氧化酶2（NOX2）、FN、IV胶原（CollagenIV）mRNA的表达变化。Western印迹法检测肾皮质内血管紧张素II1型受体相关蛋白（ARAP1）、血管紧张素II1型受体（AT1R）、NADPH氧化酶4（NOX4）、NADPH氧化酶2（NOX2）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、FN、IV胶原（CollagenIV）的蛋白表达变化。将体外培养的大鼠的肾小球系膜细胞分为正常糖组（NG）、高糖组（HG）、正常糖阴性对照组、高糖阴性对照组、正常糖+ARAP1siRNA和高糖+ARAP1siRNA组；Western-blot检测各组ARAP1、AT1R、FN蛋白的表达变化。结果：各周龄db/db小鼠体重均显著高于db/m组（p＜0.01）；乌索酸治疗6周后的db/db小鼠体重较未治疗db/db组降低（p＜0.05），治疗8周后db/db小鼠体重降低最为显著（p＜0.01）；与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠各周龄的血糖水平均明显升高（p＜0.01），UA干预6周后可降低db/db小鼠血糖（p＜0.05），10周后降糖效果更为明显（p＜0.01）；与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠尿白蛋白/尿肌酐比率显著升高（p＜0.01），给予乌索酸干预可降低尿白蛋白/尿肌酐比率（p＜0.05）。与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠出现明显的肾小球基底膜增厚和系膜基质的积聚，肾小球硬化指数显著升高（p＜0.01），乌索酸治疗组db/db小鼠肾脏组织病变显著改善（p＜0.05），肾小球硬化指数显著降III 中国医科大学硕士学位论文低（p＜0.05）。与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内ARAP1、AT1R、FN表达显著增多（p＜0.01）;而乌索酸治疗抑制了db/db小鼠肾皮质ARAP1（p＜0.05）、AT1R（p＜0.05）、FN（p＜0.05）表达。实时定量PCR法检测结果显示：与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内ARAP1、AT1、NOX4、2、FN、CollagenIVmRNA表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗可显著降低上述指标的异常增高。Western印迹结果显示：与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内ARAP1、AT1、NOX4、2、TGF-β1、FN、CollagenIV蛋白表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗可显著降低肾皮质内上述指标的异常表达。体外高糖环境培养的大鼠的肾小球系膜细胞中ARAP1、AT1R及FN蛋白的表达明显升高(p<0.01)，与正常糖组比。分别向正常糖及高糖组转染ARAP1siRNA,与高糖组相比抑制ARAP1的表达后，AT1R的表达降低，减少细胞外基质的积聚。结论：2型糖尿病db/db小鼠的肾皮质中ARAP1表达升高，促进AT1R的表达升高，从而增强AT1R其对血管紧张素II的敏感性进一步促进NOX4、2的表达，引起氧化应激的亢进；促进TGF-β1、FN和COIIV的表达，导致肾脏的纤维化病变。乌索酸可能通过下调ARAP1/AT1R信号通路抑制细胞外基质增多、肾脏纤维化和氧化应激反应，缓解2型糖尿病db/db小鼠肾脏损伤。体外高糖培养的大鼠的肾小球系膜细胞中ARAP1、AT1R及FN的表达显著升高。靶向抑制系膜细胞中ARAP1的表达后，减少了AT1R的表达，减轻细胞外基质分泌的产生。关键词：糖尿病肾病；乌索酸；血管紧张素II1型受体相关蛋白1（ARAP1）；血管紧张素II1型受体（AT1R）；氧化应激；NOX2、4；TGF-β1；FN；CollagenIV；课题资助：国家自然科学基金（81770724，81270808）;辽宁省自然科学基金(201602821)；沈阳市科技计划项目（F16⁃205⁃1⁃40）IV 中国医科大学硕士学位论文AbstractObjective:ToinvestigatewhetherARAP1expressionandtheregulationofAT1Rintype2diabeticdb/dbmiceandglomerularmesangialcellsculturedinvitroarerelatedtotheproliferationofmesangialcells,extracellularmatrixaccumulationandoxidationKanghyperthyroidism,leadingtodiabeticnephropathy.Andtoobservetheprotectiveeffectofursolicacidontype2diabeticdb/dbmiceanditseffectonARAP1andAT1Rexpression.Methods:9-week-olddb/dbmice(BKS.Cg-leprdb/leprdb)wererandomlydividedintodiabeticnephropathygroup(db/dbgroup,n=10)andursolicacidtreatmentgroup,N=10).Thesameagedb/mmice(BKS.Cg-leprdb/+,n=10)asacontrolgroup.Thebodyweightofmiceineachgroupwasmeasuredweekly;bloodglucosewasmeasuredregularly;urinaryalbumin/creatinineratiowasmeasuredat20weeksofagebyurine.Thepathologicalchangesofrenaltissueswereobservedwithlightmicroscope.TheexpressionsofangiotensinIIreceptortype1receptor(ARAP1),angiotensinIItype1receptor(AT1R)andextracellularmatrixfibronectin(FN)Variety.TheexpressionofangiotensinIIreceptortype1receptor(ARAP1),angiotensinIItype1receptor(AT1R),NADPHoxidase4(NOX4),NADPHoxidase2(NOX2),FNandcollagenIVCollagenIV)mRNAexpressionchanges.WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofARAP1,AT1R,NOX4,NOX2andTGF-β1(TGF-β1),FN,collagenIV(CollagenIV)proteinexpressionchanges.Theratglomerularmesangialcellsculturedinvitroweredividedintonormalglucosegroup(NG),normalglucosenegativecontrolgroup(HG),highglucosenegativecontrolgroup,normalglucose+ARAP1siRNAandhighglucose+ARAP1siRNAgroup-blotwasusedtodetecttheexpressionofARAP1,AT1RandFNineachgroup.Results：Thebodyweightofdb/dbmiceateachweekofagewassignificantlyhigherthanthatofdb/mgroup(p<0.01),Thebodyweightofdb/dbmicedecreasedmostsignificantlyafter8weeksoftreatment(p<0.01).Comparedwithdb/mmice,thebloodglucoselevelofdb/dbmiceincreasedsignificantlyateachweekofage(p<0.01),UAinterventionfor6weeksreducedthebloodglucoseofdb/dbmice(pV 中国医科大学硕士学位论文<0.05),andthehypoglycemiceffectbecamemoreobviousafter10weeks(p<0.01).Comparedwiththedb/dbmiceTheurinaryalbumin/creatinineratiowassignificantlyincreasedinmice(p<0.01).Ursolicacidadministrationreducedurinaryalbumin/creatinineratio(p<0.05).Comparedwithdb/mmice,db/dbmiceshowedobviousglomerularbasementmembranethickeningandmesangialmatrixaccumulation,glomerularsclerosisindexincreasedsignificantly(p<0.01),ursolicacidThetreatmentgroupdb/dbmicekidneytissuelesionssignificantlyimproved(p<0.05),glomerularsclerosisindexwassignificantlyreduced(p<0.05).Comparedwiththedb/mgroup,theexpressionofARAP1,AT1RandFNinthedb/dbgroupwassignificantlyincreased(p<0.01),whiletheursolicacidtreatmentinhibitedtheexpressionofARAP1(p<0.05),AT1R(p<0.05),FN(p<0.05)expression.Theresultsofreal-timequantitativePCRshowedthattheexpressionofARAP1,AT1,NOX4,2,FNandCollagenIVmRNAindb/dbmiceincreasedsignificantly(p<0.01)Acidtherapysignificantlyreducedtheaboveabnormalities.WesternblotresultsshowedthattheexpressionofARAP1,AT1,NOX4,2,TGF-β1,FNandCollagenIVindb/dbmiceincreasedsignificantlycomparedwithdb/mmice(p<0.01).Ursolicacidtreatmentcansignificantlyreducetheabnormalexpressionoftheseindicatorsinrenaltissue.TheexpressionofARAP1,AT1RandFNinglomerularmesangialcellsculturedinhighglucoseenvironmentinvitrowassignificantlyhigher(p<0.01)thanthatinnormalglucosegroup.ARAP1siRNAwastransfectedintonormalandhyperglycemicgroups,respectively.Comparedwithhighglucosegroup,ARAP1siRNAinhibitedARAP1expressionanddecreasedAT1Rexpression.Conclusion:IncreasedARAP1expressionintherenalcortexofdb/dbmicewithtype2diabetesmellituspromotestheexpressionofAT1R,enhancesitssensitivityandfurtherpromotestheexpressionofNOX4、2,resultingintheenhancementofoxidativestressandpromotionoftheexpressionofTGF-β1,FNandCOIIVExpression,resultinginrenalfibrosis.Ursolicacidmayreducerenaldamageintype2diabeticdb/dbmicebydown-regulatingARAP1/AT1Rsignalingpathwayandinhibitingextracellularmatrix,renalfibrosisandoxidativestress.TheexpressionofARAP1,AT1RandFNinglomerularmesangialcellsculturedinvitrowassignificantlyincreased.TargetinginhibitionofARAP1expressioninVI 中国医科大学硕士学位论文mesangialcellsreducestheexpressionofAT1Randattenuatesextracellularmatrixsecretion.Keywords:Diabeticnephropathy;ursolicacid;angiotensinIItype1receptorrelatedprotein1(ARAP1);angiotensinIItype1receptor(AT1R);oxidativestress;NOX2,4;TGF-β1;FN;CollagenIV英文缩略语英文缩写英文全称中文全称DNDiabeticnephropathy糖尿病肾病NGNormalglucose正常糖HGHighglucose高糖BWBodyweight体重ARAP1Type1angiotensinIIreceptor-血管紧张素II1受体associatedprotein相关蛋白AT1RType1angiotensinIIreceptor血管紧张素II1受体FNFibronectin纤维连接蛋白ColIVCollagenIV4型胶原TGF-β1Transforminggrowthfactor-β1转换生长因子-β1NOX4NADPHOxidase4NADPH氧化酶4UACRUrinealbumincreatinineratio尿微量白蛋白/尿肌酐比率UAUrsolicacid乌索酸VII 中国医科大学硕士学位论文目录摘要……………………………………………………………………ⅢAbstract…………………………………………………………………Ⅴ英文缩略语………………………………………………………………………Ⅶ1前言………………………………………………………………………………12材料与方法……………………………………………………………………22.1实验材料…………………………………………………………………22.2实验方法………………………………………………………………42.3结果的计算与分析方法…………………………………………………153结果……………………………………………………………………………153.1乌索酸对糖尿病db/db小鼠体重的影响………………………………153.2乌索酸对糖尿病db/db小鼠血糖水平的影响…………………………163.3乌索酸对糖尿病db/db小鼠尿白蛋白/肌酐比率的影响……173.4乌索酸对糖尿病db/db小鼠肾组织病理学的影响……………………183.5乌索酸对糖尿病db/db小鼠肾皮质ARAP1、AT1R表达量的影响……183.6乌索酸对糖尿病db/db小鼠肾皮质Nox2、4表达量的影响…………203.7乌索酸对糖尿病db/db小鼠肾皮质TGF-β1、FN和ColIV表达量的影响……………………………………………………………………………203.8靶向抑制系膜细胞中ARAP1的表达减少AT1R的表达，减轻细胞外基质分泌产生…………………………………………………………………224讨论……………………………………………………………………………245结论……………………………………………………………………………27本研究创新性的自我评价……………………………………………………28参考文献………………………………………………………………………29文献综述……………………………………………………………………………32致谢……………………………………………………………………………42个人简历……………………………………………………………………………43VIII 中国医科大学硕士学位论文ARAP1/AT1R信号通路在糖尿病肾病发病机制中的作用及干预研究1前言糖尿病患病率预计将从2010年的6.4％上升至2030年的7.7％[1]。糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN）作为糖尿病一个主要的晚期并发症，发生于大约三分之一的糖尿病患者，是终末期肾病（ESRD）的最常见原因，也是糖尿病病人死亡的主要原因[2]。DN确切的发病机制至今尚未阐明,临床应用的药物不能有效地逆转DN的进程,迫切需要探求新的诊治方法。血管紧张素II（AngiotensinII，AngII）是肾素血管紧张素系统（Reninangiotensinsystem，RAS）中最重要的组成成分，其下游受体AngII1型受体（AngiotensinIItype1receptor，AT1R）在促炎、刺激生长、促进纤维化和氧自由基的生成中发挥关键作用[3,4]。AT1R相关蛋白已经被证实可以局部调控AT1R的功能，郭等人发现了一个AT1R的相关蛋白质,即血管紧张素II1型受体相关蛋白1（AT1receptor-associatedprotein1，ARAP1)[5]。ARAP1是RAS系统的一个成员，它结合AT1R的C-端区域，可促进受体循环到细胞膜，增加AT1R对血管紧张素II的敏感性，激活RAS系统[6]。然而，尚不明确ARAP1是否通过调控AT1R参与调控糖尿病肾脏病变。乌索酸（Ursolicacid，UA）是一种来源于浆果、水果、以及许多药用植物的叶子和花的五环三萜类化合物，作为一种抗肿瘤、抗炎、降血糖和免疫治疗药物已在亚洲被使用了几个世纪[7,8]。然而其确切的分子机制以及潜在的有益作用仍不清楚。课题组前期研究证明乌索酸可能通过抑制高糖培养系膜细胞内miRNA-21的过表达，上调PTEN表达，抑制P13K/Akt/mTOR信号通路异常活化，加强自噬从而减少细胞外基质聚集，减轻细胞肥大、增殖。在DN中ARAP1的表达变化，与AT1R之间的相互调控的作用，引起的DN的肾脏病理损伤，以及乌索酸对2型糖尿病db/db小鼠的肾脏保护作用以及对ARAP1和AT1R的表达的影响，尚未见文献报道。1 中国医科大学硕士学位论文2材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞来源大鼠肾小球系膜细胞株购自中国典型培养物保藏中心2.1.2实验动物9周龄（SPF）级雄性自发性2型糖尿病db/db小鼠（BKS.Cg-leprdb/leprdb）20只和db/m（BKS.Cg-leprdb/+）小鼠10只，购自于南京大学-南京生物医药研究院（中国江苏），许可证号：SCXK（苏）2015-0001。所有小鼠均饲养在中国医科大学动物部SPF级动物房中，分笼饲养，每笼3-4只，给予普通小鼠饲料，自由进食进水，温度23±3℃，湿度50%±20%，室内通风良好，自然光线照明。实验动物在实验正式开始前适应性观察饲养一周。2.1.3主要试剂材料来源DMEM培养基Hyclone，美国0.25%胰蛋白酶Gibco，美国胎牛血清Gemini，美国D-葡萄糖Sigma，美国ARAP1siRNA百奥迈科，中国乌索酸（动物用）北京索莱宝，中国TrizolInvitrogen，美国氯仿、异丙醇、无水乙醇国药集团有限公司，中国ARAP1抗体武汉三鹰，中国AT1R抗体Sigma，美国FN抗体、ColIV抗体武汉三鹰，中国2 中国医科大学硕士学位论文NOX4、TGF-β1抗体abcam,英国GAPDH抗体武汉三鹰，中国ECL发光液、蛋白彩虹markerThermoFisherScietific，美国PVDF膜Millipore，美国BCA蛋白定量试剂盒碧云天，中国RIPA蛋白裂解液碧云天，中国PMSF碧云天，中国丙烯酰胺，TrisBase、TEMED索莱宝，中国APS、甘氨酸、Tween20索莱宝，中国脱脂奶粉伊利，中国戊二醛Sigma，美国水合氯醛Sigma，美国甲醛北京化学试剂公司，中国二甲苯、乙醇国药集团有限公司，中国3%H2O2、DAB显色液中杉金桥，中国Tris碱Sigma，美国PAS染色试剂盒索莱宝，中国苏木素碧云天，中国卓越型血糖仪罗氏，德国尿微量白蛋白检测试剂盒Assaypro，美国尿肌酐测试盒（苦味酸法）南京建成，中国2.1.4主要仪器仪器来源CO2孵箱NAPCO，Model54103 中国医科大学硕士学位论文超净工作台SW-CJ-IF，苏州倒置显微镜OLYMPUS，日本分光光度计MOLECULARDEVICE，美国高速冷冻离心机STRATOSKENDRO，美国电泳仪DYY-6C型，中国转印电泳系统Bio-rad，美国电子分析天平Sartorius，美国组织匀浆器天根生化科技，中国移液器吉尔森，法国照相显微镜OLYMPUS，日本眼用手术剪苏州施强医疗器械，中国石蜡切片机、自动脱水机Leica，德国烤片机、自动包埋机Leica，德国电磁炉美的，中国高温压力锅THC，日本防脱载玻片Sukura，日本盖玻片三和新华玻璃实验仪器，中国湿盒中杉金桥，中国2.2实验方法2.2.1动物分组及处理方案将所有实验动物置于SPF级别屏障环境内，适应性饲养一周后。将10只18-21g雄性db/m（BKS.Cg-leprdb/+）小鼠作为正常对照组（db/m）；20只36-41g雄性自发性2型糖尿病db/db小鼠（BKS.Cg-leprdb/leprdb）按照空腹体重将其随机4 中国医科大学硕士学位论文分为两组，糖尿病肾病动物模型组（db/db）及乌索酸治疗组（db/db+UA）。乌索酸治疗组小鼠给予0.3%乌索酸（每100g正常小鼠饲料加入0.3g乌索酸）饮食，饲养共10周，喂至20周龄时取材。所有实验动物耳标法进行编号，且整个实验期间，所有实验动物均未经过降糖药物的治疗。2.2.2体重的测量每周使用电子分析天平分别测量各组小鼠体重并做相应纪录，共10周。2.2.3空腹血糖（FBG）的测定定期检测各组小鼠空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG）。每次检测前各组小鼠均需禁食12小时，但不限制饮水，断尾法取尾静脉血，后使用便携式血糖仪测量每组小鼠血糖并做相应纪录。2.2.4尿微量白蛋白的检测各组小鼠于20周龄时随机留取尿液，将其充分混匀后，使用离心机3500rpm/min，离心10分钟，收集上清于无菌EP管中，-80℃冰箱储存备用。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠尿中微量白蛋白水平。（1）实验前将所有试剂置于室温10分钟，尿液稀释400倍，实验过程在室温下进行（20-25℃）；（2）每孔中加入50μl小鼠尿白蛋白的标准品，封板孵育2个小时，从末次加样后开始计时；（3）去除酶标板中液体，每孔中加入200μl洗液浸泡1分钟后将其移除，反复清洗5次；（4）每孔中加入生物酰化小鼠白蛋白抗体50μl，后孵育1小时；（5）清洗步骤同上（3）；（6）每孔内加入过氧化物酶标记链霉亲和素50μl，孵育半个小时；（7）清洗步骤同上（3）；（8）每孔内加入底物反应液50μl，孵育15分钟或者直到液体颜色变蓝为止；（9）每孔内各加入终止液50μl，观察液体颜色由蓝色变为黄色；（10）用酶标仪测量各孔的吸光度（OD）值，波长为450nm。绘制标准曲线，并且根据每个样品的吸光值，计算出相应的浓度，后乘以400便可得到实际浓度。5 中国医科大学硕士学位论文2.2.5尿肌酐的检测（苦味酸法）（1）处理标本，根据说明书提示制作标准曲线；（2）各组标本用双蒸水做1：200稀释，按下表进行测定；（ml）空白管标准管测定管稀释尿液1.6试剂一（50μmol/L肌酐标准品）1.6双蒸水1.6试剂三（苦味酸溶液）0.50.50.5试剂四（0.75mol/L氢氧化钠溶液）0.50.50.5（3）将反应液充分混和均匀后，放入37℃水浴锅中10分钟，取出后自来水冷却冲洗，波长510nm，用双蒸水调零后，测定各组标本的吸光度（OD）值，计算出各组相应尿肌酐浓度。2.2.6肾脏标本的采集各组小鼠处死前需禁食12个小时，但饮水不限。使用10%水合氯醛进行麻醉，剪开胸骨露出心脏后，立即用冷却的生理盐水进行心脏灌流，待肾组织中的血液去除后，开腹取出肾脏，剔除肾被膜，置于生理盐水中浸泡。将每侧肾脏沿中线纵向切开，局部肾组织用10%中性甲醛固定后，石蜡包埋切片，进行过碘酸-雪夫染色（PAS），用来观察肾脏形态学改变。另一部分肾脏组织放入-80℃保存。2.2.7肾脏组织PAS、MASSON染色（1）把要包埋的肾组织从10%中性甲醛固定液中取出，逐一进行脱水浸蜡等步骤，具体过程如下：6 中国医科大学硕士学位论文脱蜡浸蜡后进行石蜡包埋后，石蜡切片机上行2μm连续切片，烤片后进行后续实验步骤。（2）PAS染色1）切片2μm，对其进行常规脱蜡处理，步骤如下；2）使用0.5%过碘酸溶液氧化6分钟；3）蒸馏水冲洗；4）希夫氏试剂染色8分钟，肉眼看标本变红；5）自来水冲洗5分钟；6）苏木素复染2分钟；7 中国医科大学硕士学位论文7）自来水冲洗1分钟；8）分别依次浸入95%酒精3分钟×2次，100%酒精3分钟×2次脱水；用二甲苯透明；使用中性树胶进行封片；9）在光学显微镜下观察肾小球基底膜、系膜基质等肾脏病理变化。计算肾小球的硬化指数（GSI）：每张切片随机选择20个肾小球，将肾小球的硬化程度分为0~4级。0级代表正常，1级代表硬化面积＜25%，2级代表硬化面积为25%~50%，3级代表硬化面积为50%~75%，4级代表硬化面积为75%~100%；GSI公式为（1×N1硬化数+2×N2硬化数+3×N3硬化数+4×N4硬化数）/30×100%。（3）MASSON染色1）将石蜡切片脱蜡至水；2）蒸馏水洗；3）用Masson丽春红酸性复红液8min；4）以0.2%冰醋酸水溶液洗片刻；5）1%磷钼酸水溶液分化3min；6）苯胺蓝或光绿液染5min；7）以0.2%冰醋酸水溶液洗片刻；8）分别依次浸入95%酒精3分钟×2次，100%酒精3分钟×2次脱水；后用二甲苯透明；中性树胶封片；9）在光学显微镜下观察肾小球基底膜、系膜基质等肾脏病理变化。计算肾小球的硬化指数（GSI）：每张切片随机选择30个肾小球，将肾小球的硬化程度分为0~4级。0级代表正常；1级代表硬化面积＜25%；2级代表硬化面积为25%~50%；3级代表硬化面积为50%~75%；4级代表硬化面积为75%~100%；GSI公式为（1×N1硬化数+2×N2硬化数+3×N3硬化数+4×N4硬化数）/30×100%。2.2.8肾脏免疫组织化学染色（1）肾脏组织制备石蜡切片和脱蜡步骤同PAS、Masson；（2）不同浓度乙醇进行水化；（3）TBS缓冲液冲洗3分钟×3次；（4）抗原修复：抗原修复液Tris-EDTA，pH值为9.0，将标本用高压锅煮沸，自来水冲洗1分钟，室温冷却30分钟；（5）滴入内源性过氧化物酶抑制剂50μl，室温下孵育0.5小时；（6）TBS缓冲液冲洗3分钟×3次；8 中国医科大学硕士学位论文（7）非免疫动物血清进行封闭，室温下孵育0.5小时；（8）去除血清后，用抗体稀释液稀释一抗，滴入肾组织中放入湿盒内，在4℃孵育过夜（ARAP1抗体稀释比例为1：100；FN抗体稀释比例为1：50；ColIV抗体稀释比例为1：50）；（9）将湿盒拿至室温内复温0.5小时；（10）TBS缓冲液冲洗3分钟×3次；（11）组织上滴加二抗，室温下孵育0.5小时；（12）TBS缓冲液冲洗3分钟×3次；（13）每个样本中加入100-200μl的DAB显色液，室温下孵育3-10分钟，直至形成棕黄色反应物；（14）流水冲洗1分钟，终止显色反应；（15）使用苏木素复染10-30秒至细胞核变成蓝色；（16）自来水冲洗2分钟；（17）分化液孵育30秒；（18）自来水冲洗1分钟；（19）返蓝液孵育30秒；（20）自来水冲洗1分钟；（21）脱水、封片步骤同PAS、Masson。2.2.9实时定量PCR法检测相关mRNA表达量（1）RNA提取：将各组小鼠肾皮质剪碎后，用超声粉碎机粉碎，各组样本中加入1mlTrizol，室温静置5min，使用吸管反复吹打，重复操作4遍，使细胞能够充分裂解，提取放至无菌EP管中，4℃，12000r/min，离心15min；将上清液移到另一无菌的EP管中，加入1/5等体积的氯仿，充份混匀并室温放置5min后，4℃，12000r/min，离心15min；取上清，加等量的异丙醇，倒置混匀后，-20℃冰箱过夜；4℃，12000r/min，离心5min；弃上清液，沉淀为RNA；用无水乙醇1ml洗涤沉淀3次，4℃，9500rpm，离心5min，；弃上清，充分干燥，用滤纸吸去剩下的水分。根据RNA沉淀的量加入一定体积的DEPC水将其溶解，形成反转录的模板。取1μlRNA，紫外分光光度计下测定A260及A280的OD值。计算公式为：RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（ng/μl）。计算A260/A280比率，保留比率在1.8-2.0范围内的样本进行逆转录。（2）逆转录：9 中国医科大学硕士学位论文①10μl反应体系：RandomPrimers1.0μl、Oligo（dT）15Primer(500μg/ml)1.0μl、RNA5μl、Nuclease-FreeWater3μl。反应条件：70℃5min，冰上冷却3min。②20μl总反应体系：GoScriptTMReverseTranscriptase1.0μl、Nuclease-FreeWater1.6μl、5×PrimeScript.Buffer(forRealTime)4μl、MgCl2（25mM）2μl、dNTPMix（10mM）1μl、rRNasinRNaseInhibitor0.4μl、RNA样10μl。反应条件：25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min。（3）实时定量PCR：总体积为20ulPCR反应体系。反应体系：SYBR.PremixExTaqTM（2×）10μl、ForwardPrimer0.4μl、ReversePrimer0.4μl、RNaseFreedH2O7.2μl、cDNA2.0μl。反应条件为：94℃5min，95℃5s，60℃30s，72℃30s，经过扩增40个循环。同时以GAPDH为内参，数据处理采用2-⊿⊿CT，各个试验组重复3次。引物的设计：ARAP1上游5'–CCTTACCAGTCTCCCATCTT-3'，下游5'-GTGCTGTGACCATCCTCC-3'。AT1R上游5'–TTGTCCACCCGATGAAGTCTC-3'，下游5'–AAAAGCGCAAACAGTGATATTGG-3'。Nox4上游5'–TGCCTGCTCATTTGGCTGT-3'，下游5'–CCGGCACATAGGTAAAAGGATG-3'。Nox2上游5'–TTGGTTCGGTTTTGG-3',下游5'–TTGGGGCACTTGACA-3'。FN上游5'–GACAACCGAGGAAACC-3',下游5'–CAGTGAAGGAGCCAGAT-3'。ColIV上游5'–GTCGTGGAGACATCGG-3',下游5'–CCTGCCTCACCCTTT-3'。GAPDH上游5'–AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。2.2.10Westernbolt检测相关蛋白（1）提取各组肾皮质总蛋白将各组小鼠麻醉后处死，取出肾脏，剔除肾包膜，用PBS反复冲洗后放在冰上预冷的研磨器中。剪碎后放入RIPA蛋白提取液和PMSF蛋白酶抑制剂（每0.1g组织放入1mlRIPA和10ulPMSF）,研磨到肾皮质溶液混合均匀，肉眼看不到组织为止。将组织研磨液转移到1.5ml无菌EP管内，放在冰上反应1小时后离心，12000rpm,4℃，15分钟，上清液为蛋白溶液，提取上清，转移到无菌EP管中，完成蛋白的提取。（2）蛋白质的定量操作过程按照BCA蛋白质测定试剂盒说明书来操作：将0.5mg/ml的BSA蛋白标准液以不同的体积分别滴加0、1、2、4、8、12、16、20μl到酶标板的不10 中国医科大学硕士学位论文同孔中，如孔中体积有剩余，则用PBS缓冲液添加到20μl，制备成标准曲线待测液；每组样本蛋白提取物1μl加入不同孔内，并向其中加入19μlPBS缓冲液混匀，制成蛋白待测液；分别向样品及标准线管中加200μlBCA工作液，混合均匀后，在37℃条件下反应0.5小时，溶液颜色由绿色变成紫色后；酶标板放在载台上，设定波长为570nm，测定570nm处吸光值，同时进行数据记录，画出标准曲线，乘以稀释倍数，即可得到蛋白样品的实际浓度。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳①安装电泳槽装置：使用洗洁精清洗干净玻璃板，再用蒸馏水冲掉覆盖在上面的洗洁精，在室温下晾干，确认表面无污渍和灰尘后方可开始进行安装。底部对齐，用支架固定，将两面夹紧，用吸管将蒸馏水缓慢的灌入两块玻璃板之间，静置3min后，观察水面是否下降，确认底边密封好后，可开始灌胶。②聚丙烯酰胺凝胶制备：根据所需目的片段分子量的大小选择配制与之相匹配的浓度的分离胶，本实验浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%。配制分离胶：按照配制分离胶的配方依次放入小烧杯中后，注意灌胶前放入APS、TEMED即可，充分混和均匀后，用移液枪缓慢的将分离胶加入到两个玻璃板之间，预留出浓缩胶的灌注空间，然后立即使用吸管注入去离子水封闭分离胶（尽量不要有气泡残留其中）使其隔绝空气，室温条件下静置等待胶凝固；配制浓缩胶：当分离胶凝固完全后，倒掉上面的水封层，用干净的滤纸条吸干两玻璃板之间的多余水份（切记不要将滤纸条碰到分离胶），配制好的浓缩胶灌入两玻璃板之间，马上插入事先清洗干净的梳子（动作尽量要快，不要出现气泡），放置于室温条件下，静置等待凝固。各个浓度的聚丙烯酰胺配方如下：分离胶浓度双蒸水30%Acr-Bis分离胶缓冲液10%APSTEMED（29:1）10%分离4.17ml3.33ml2.5ml0.1ml0.004ml胶12%分离3.5ml4.0ml2.5ml0.1ml0.004ml胶浓缩胶1.71ml0.51ml0.75ml0.03ml0.003ml（3）电泳提前配置好电泳缓冲液充分混匀后，将凝固的含胶玻璃板和电泳装置连接组11 中国医科大学硕士学位论文装，倒入电泳缓冲液后，仔细的检查是否有漏液，无误后小心缓慢的拔除凝胶内梳子，避免损伤浓缩胶，小心向胶的孔中加入一定量蛋白以及少量的蛋白彩虹Marker，小心避免蛋白溢出。向槽内加入适量电泳液，连好装置后90V一直跑到底。（4）切胶电泳结束后，将胶片取出，期间注意要保持胶的湿润度，并且防止胶碎裂的，去除浓缩胶后，根据彩虹Marker位置切出胶片，将胶片浸入转膜液中备用。小心打开转印夹，首先找到黑色夹子的那一面（负极），依次放置海绵一块及干净滤纸三层，放置前将要使滤纸和海绵放入转膜液中充分湿润，将切好的胶整齐放置在滤纸上，切勿出现气泡，裁剪出相应胶大的PVDF膜，注意PVDF膜要稍大于胶，PVDF膜在甲醇中浸入3分钟，然后将其放置于胶上，同时要保证胶与膜完整贴合无气泡，随后再在膜上放置三层湿润的滤纸，最后在其上面放置一层浸湿海绵。以上放置完毕后，放置于槽中，倒入预先配置好预冷的转膜液，正确装好电极，4℃情况下转膜（恒流200mA持续转膜90min）。（5）抗体孵育转膜结束，拿出转印夹，小心用平头镊子拿出PVDF膜，洗涤液（TBST）清洗PVDF膜3次，每次五分钟，伊利脱脂奶粉溶解在TBST中，使其最终浓度为5％，将PVDF膜浸泡于脱脂奶粉溶液中，室温情况下孵育2h，再用TBST清洗3次，每次5分钟，后分别将一抗溶于抗体稀释液，使膜完全浸泡在稀释后的抗体中，4℃条件下摇床过夜，使膜上蛋白与抗体充分反映。第二天将PVDF膜取出，用TBST清洗3次，一次10分钟，加入二抗（1:10000）室温摇床孵育2h。TBST清洗后，加入配置好的ECL发光液（发光液应现用现配）发光并分析。抗体稀释比例如下名称比例ARAP11:500AT1R1:400FN、COXIV1:500TGF-β11:500NOX4、21:1000GAPDH1:200012 中国医科大学硕士学位论文2.2.11细胞复苏（1）从液氮中拿出大鼠系膜细胞株，放在37℃的水浴箱中快速轻轻摇动，将其在短时间内融解；（2）用乙醇擦拭冻存管，后放入超净台中，吸出细胞悬液，转入离心管中。向管中缓慢滴加培养基，后用吸管多次轻轻吹打，定容至10ml，置于离心机中，1000rpm，3分钟；（3）丢去管中的上清液，放入3ml培养基和2mlIFN-γ，混和均匀，制成细胞悬液；（4）将步骤（3）中的细胞悬液转移至培养瓶中，置于37℃孵箱中，培养过夜后换液，持续培养。2.2.12细胞消化和传代（1）细胞融合度到达70%以上时，丢去培养基，加入适量的PBS缓慢摇晃清洗，倒掉PBS的清洗液；（2）向培养瓶中放入胰酶（25cm2培养瓶加1ml；75cm2培养瓶加2ml），并且轻轻晃动后置于37℃孵箱消化3分钟，拿出后置于显微镜下，发现细胞胞质回缩，慢慢变圆，敲打瓶底会有细胞脱落。用乙醇擦培养瓶后放入超净台内。（3）向培养瓶中加入适量的培养基终止消化，并反复的轻轻吹打，置于显微镜下观察发现几乎所有的细胞都已经消化下来；（4）将培养瓶中的细胞悬液吸出，加入无菌离心管中，定容至10ml，放入离心机中，1000rpm，3分钟；（5）离心后弃去上清液，向管内加入适量培养基，无菌吸管多次的吹打，混和均匀，制备成细胞悬液；（6）按合理的比例转移细胞悬液至新的培养瓶中，放入37℃的孵箱中进行传代。2.2.13细胞冻存（1）提前配置好的冻存液，血清与DMSO比例为9：1，混匀后置于4℃；（2）将处在对数生长期状态良好的细胞冻存的前一天换液，按上述提及到的方式进行消化后，将细胞悬液吸出至无菌的离心管中，1000rpm，3分钟；13 中国医科大学硕士学位论文（3）离心后丢去离心管内的上清液，向管中缓慢的滴加冻存液，后用吸管轻轻的反复吹打，混匀，转至冻存管中；（4）每个冻存管进行标记，4℃放置10-30分钟，-20℃放置30分钟，-80℃过夜后转移至液氮中继续保存。2.2.14ARAP1-siRNA转染系膜细胞（1）转染24小时前，计数系膜细胞并且以5x104/孔的密度接种于24孔板。并且在不含抗生素的培养基中培养，待次日密度达80-90%，进行后续的实验。（2）转染前的30分钟拿出培养板，除去原有的细胞培养基，换上500μlopti-MEM培养基，将细胞放回培养箱中继续培养。（3）配制液I：用500µLOpti-MEM稀释10µLARAP1-siRNA，轻轻的吹吸3-5次混匀。（4）配制液II：用500µLOpti-MEM稀释10µLLipofectamineTM2000，轻轻的吹吸3–5次混匀，室温下静置5min。（5）配制液I与II混合，吹吸3-5次混和均匀后，室温下放置20min。（6）转染的复合液放入到24孔的细胞板中，100µL/孔，上下的轻摇细胞板混均。（7）将细胞板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养18-48hrs。转染6hrs后除去细胞上清，更替为无抗生素的完全培养基。（8）转染24h后加入各组的处理因素干预24h。2.2.15实验分组按参考文献及预试验结果，采用无血清培养基同步化24h，进行试验分组：正常糖(NG，5．5mmol／L葡萄糖)、高糖组(HG，25mmol／L葡萄糖)，正常糖+空质粒组(NG，5．5mmol／L葡萄糖)、高糖+空质粒组(HG，25mmol／L葡萄糖)、正常糖+ARAP1-siARAP1、高糖+ARAP1-siRNA。2.2.16Westernbolt检测相关蛋白（1）提取各组细胞总蛋白将加入不同处理因素的各组细胞小心的吸取上清液后，使用预冷的PBS进行冲洗，后加入适量PBS，使用细胞刮刀轻轻的刮取细胞，注意小心避免使细胞破碎，待细胞全部离壁后，小心的收集细胞悬浮液，使用预冷的PBS清洗细胞沉淀反复三次的清洗后彻底弃去上清液，使用干净的滤纸尽可能的将上清全部吸14 中国医科大学硕士学位论文净。后放入有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，缓慢吹匀细胞并使细胞悬浮在裂解液中，在冰上充分的裂解30分钟，离心机以12000g的速度离心15分钟后提取上清，使用BSA蛋白定量的试剂盒对各组上清液进行浓度的测定，计算并且统一调整各组细胞蛋白的浓度，后放入上样的缓冲液，在100℃水中煮10分钟变性，并于-80℃储存，备用。（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶、抗体孵育同动物实验部分。2.3统计学分析该部分实验中的所有的实验为确保可重复性和真实性，均至少重复了三次以上的实验，结果表达的形式为均数±标准差，即为x̅±s，将这些数据的统计学计算过程均由软件SPSS计算完成，统计方法两组间的比较采用t检验，单因素方差分析（多组间的比较），用Levene检验进行方差一致性的检验，并且选用SNK方法完成组间的比较。统计学意义标准为：P值小于0.05表示具有统计学差异，P值小于0.01则表示统计学差异非常显著，其余表示没有统计学意义。3结果3.1乌索酸（UA）治疗后糖尿病db/db小鼠体重的变化情况db/db小鼠为世界范围内的公认的研究糖尿病肾病的理想模型。本研究中所用db/db小鼠于9周龄购入，10周龄始进入实验，饲养到20周。每周测量各组小鼠的体重，结果发现，随着各组小鼠周龄的增长，体重也随之增加，且各周龄db/db小鼠的体重均显著高于db/m组（p＜0.01）；0.3%乌索酸干预6周后（16周龄）体重较db/db开始降低（p＜0.05），干预8周后（18周龄）降低db/db小鼠体重的效果最为显著（p＜0.01）见图1。15 中国医科大学硕士学位论文a图1、乌索酸（UA）减轻2型糖尿病db/db小鼠的体重。A、每周测量小鼠的体重。Pbc＜0.05与对照组（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相比，P＜0.01与糖尿病#*组（db/db）相比；B、P＜0.05与对照组（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相**比，P＜0.01与糖尿病组（db/db）相比；C、正常组db/m小鼠，糖尿病组db/db小鼠，治疗组db/db+UA小鼠。3.2乌索酸对糖尿病db/db小鼠血糖水平的影响在不同的时间点检测各组小鼠的血糖水平变化（10、12、16、20周龄），结果发现，各时间点db/db小鼠血糖水平均显著的高于db/m小鼠（p＜0.01）；给予UA治疗6周后（16周龄）可降低db/db小鼠的血糖（p＜0.05），治疗10周后（20周龄）降糖的效果更为明显（p＜0.01）见图2。16 中国医科大学硕士学位论文a图2、UA降低糖尿病db/db小鼠血糖水平。A、断尾法取血测量每组小鼠血糖。P＜bc0.05与对照组（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相比，P＜0.01与糖尿病组#*（db/db）相比；B、P＜0.05与对照组（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相**比，P＜0.01与糖尿病组（db/db）相比。3.3乌索酸对db/db小鼠尿白蛋白/肌酐比率的影响各组小鼠于20周龄留取随机尿液，计算尿白蛋白/尿肌酐比率，结果发现db/db小鼠尿白蛋白/尿肌酐比率显著高于db/m小鼠（p＜0.01）；UA治疗可降低db/db小鼠尿白蛋白/尿肌酐比率（p＜0.05）见图3。图3、UA降低糖尿病db/db小鼠尿微量白蛋白/肌酐（20W）。A、20W留取各组小鼠尿液，aELISA试剂盒检测小鼠尿微量白蛋白，苦味酸法检测小鼠尿肌酐。P＜0.05与对照组b***（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相比；B、P＜0.05，P＜0.01。17 中国医科大学硕士学位论文3.4肾组织病理学改变20周留取肾组织，Masson和PAS染色结果表明，与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾脏组织出现明显的肾小球基底膜增厚和系膜基质的积累肾小球硬化指数显著升高（p＜0.01），给予乌索酸干预组db/db小鼠肾脏组织的上述表现显著改善（p＜0.01），肾小球硬化指数显著降低（p＜0.01）。见图4。图4：A：20W留取小鼠肾组织，Masson染色分析小鼠肾小球系膜基质增生程度。B：*#Masson染色半定量分析。P＜0.01与对照组（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相比。C：Pas染色分析小鼠肾小球系膜基质增生程度。D：Pas染色半定量分*#析。P＜0.01与对照组（db/m）相比，P＜0.05与糖尿病组（db/db）相比。N=103．5各组小鼠肾皮质ARAP1、AT1R表达变化Western印迹结果显示：与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内ARAP1和AT1蛋白表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗后可显著降低肾皮质内上述指标的表达（p＜0.05）。实时定量PCR法检测小鼠肾皮质中ARAP1和AT118 中国医科大学硕士学位论文RmRNA表达量，结果显示与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内ARAP1和AT1mRNA表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗后可显著降低肾组织内上述指标的表达。见图5。20周留取各组小鼠肾组织，制作石蜡切片。免疫组化染色结果表明，db/db组小鼠肾皮质内ARAP1和AT1R表达显著增多与db/m组小鼠相比（p＜0.01）;而乌索酸干预组小鼠与db/db组小鼠相比肾皮质内ARAP1和AT1R表达明显降低（p＜0.05）见图6。图5：A、B：RT-qPCR检测ARAP1、AT1RmRNA的表达变化。C、Westernblot检测各组ARAP1、AT1R蛋白的表达变化。D、E：对Westernblot结果进行半定量分析。与正常组比#***较，P<0.01；与糖尿病组比较，P<0.05，P<0.01。图6：A、C：20W留取小鼠肾组织，免疫组化法检测各组小鼠肾脏ARAP1、AT1R蛋白的表19 中国医科大学硕士学位论文#*达变化。B、D：免疫组化的半定量分析。与正常组比较，P<0.01；与糖尿病组比较，P<0.05。3.6各组小鼠肾皮质NOX2、NOX4表达变化。Western印迹结果显示：与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内NOX2和NOX4蛋白表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗后可显著降低肾组织内上述指标的表达（p＜0.05）。实时定量PCR法检测小鼠肾皮质中NOX2和NOX4mRNA表达量，结果显示与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内NOX2和NOX4表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗后可显著降低肾皮质内上述指标的表达（p＜0.05）见图7。图7：A、B：RT-qPCR检测NOX4、NOX2mRNA的表达变化。C、Westernblot检测各组NOX2、NOX4蛋白的表达变化。D、E：对Westernblot结果进行半定量分析:与正常组比#***较，P<0.01；与糖尿病组比较，P<0.05，P<0.01。3．7各组小鼠肾皮质TGF-β1、FN和ColIV表达变化。Western印迹结果显示：与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内TGF-β1、FN和ColIV蛋白表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗后可显著降低肾皮质内上述指标的表达（p＜0.01）。实时定量PCR法检测小鼠肾皮质中FN和20 中国医科大学硕士学位论文ColIVmRNA表达量，结果显示与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠肾皮质内FN和ColIV表达显著增加（p＜0.01）；乌索酸治疗后可显著降低肾皮质内上述指标的表达见图8。20周留取各组小鼠肾组织，制作石蜡切片。免疫组化染色结果表明，db/db组小鼠肾皮质内FN表达显著增多与db/m组小鼠相比（p＜0.01）;而乌索酸干预组小鼠与db/db组小鼠相比肾皮质内FN表达明显降低见图9。图8：A、B：RT-qPCR检测FN、COlIVmRNA的表达变化。C、Westernblot检测各组FN、COlIV、TGF-β1蛋白的表达变化。D、E、F：对Westernblot结果进行半定量分#***析。与正常组比较，P<0.01；与糖尿病组比较，P<0.05，P<0.01。21 中国医科大学硕士学位论文图9：A：20W留取小鼠肾组织，免疫组化法检测各组小鼠肾脏FN蛋白的表达变化。B：免疫#***组化的半定量分析。与正常组比较，P<0.01；与糖尿病组比较，P<0.05，P<0.01。3.8靶向抑制系膜细胞中ARAP1的表达减少AT1R的表达，减轻细胞外基质分泌产生将controlsiRNA和ARAP1siRNA分别转染至体外正常糖和高糖培养的系膜细胞中，继续培养24h，westernblot检测ARAP1、AT1R及FN的蛋白表达情况。结果显示：与正常糖组比较，高糖组ARAP1、AT1R及FN的表达明显升高（P<0.01）。与空质粒组相比，ARAP1siRNA组可显著降低ARAP1、AT1R及FN的表达（p<0.05）。（见图10）22 中国医科大学硕士学位论文图10：A：Westernblot检测各组ARAP1、AT1R和FN蛋白的表达变化。B、C、D：对#*Westernblot结果进行半定量分析，与正常糖组比较，P＜0.01；与高糖组比较，P＜0.05；n=3。23 中国医科大学硕士学位论文4讨论肾组织定位的活化的肾素-血管紧张素系统（RAS）在DN发展中起重要作用[9,10]。AngII是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要活性肽物质，AngII通过与其AngII1型受体（AT1R）的结合，发挥其主要的病理生理作用，在DN的发病机理中起关键作用。ACEI和ARB类药物是目前糖尿病肾病最有效的治疗方法，可以减轻白蛋白尿的发生，延缓肾功能损害，减轻肾组织结构的病理损伤[11,12,13]。ARAP1是RAS系统的一个成员，它结合1型血管紧张素II受体（AT1R）的C-端区域，可促AT1R进受体循环到细胞膜，从而增加AT1R的表达量及对血管紧张素II的敏感性[6]。研究发现ARAP1在小鼠各种器官中都有表达，在心脏、肾脏、主动脉和肾上腺中的表达量最多。肾脏中ARAP1主要表达于脉管系统和肾小球系膜细胞。ARAP1在小鼠肾小球系膜细胞表达，通过调控AT1R介导的血管紧张素II信号参与系膜细胞生长和细胞外基质蛋白质分泌，包括ColⅣ和纤维连接蛋白。ARAP1可以通过调控血管紧张素II1型受体的表达从而参与调控其下游的磷脂酶Ｃ、蛋白激酶、酪氨酸激酶/磷酸酶、Rho激酶、NADPH氧化酶和活性氧的产生，进一步参与调节血管内皮功能障碍和高反应性，从而影响血管平滑肌细胞的生长、凋亡、纤维化、高收缩、钙化和炎症相关的巨噬细胞浸润以及增加的氧化还原的敏感性[14]。近端小管过表达Arap1的转基因小鼠表现为盐敏感和血管紧张素II依赖性高血压，伴明显的肾脏肥大[15]。这些数据表明ARAP1增强AT1R依赖性的肾脏信号传导。有文献报道称患有内毒素血症的小鼠血压明显降低，虽然其体内的血管紧张素II浓度是增加的，但是ARAP1和AT1R的表达明显减少。在体外环境应用促炎症因子对系膜细胞进行干预后，系膜细胞中ARAP1和AT1R的表达均明显减少，然而在给予血管紧张素转换酶抑制剂后，其表达有所增加[16]。在糖尿病肾病的状态下，肾脏也会产生大量的促炎症因子，并且体内血管紧张素II的浓度增高，但有关糖尿病肾病中ARAP1和AT1R之间的相互调控作用，及其对糖尿病肾脏损伤的作用，尚未见文献报道。本研究发现20周龄2型糖尿病db/db小鼠肾皮质及体外高糖培养的系膜细胞中ARAP1、AT1R的表达显著升高提示ARAP1和AT1R可能参与了DN的病理损伤。NOX在许多组织中表达并介导多种生物学功能，包括调节细胞内信号传导。24 中国医科大学硕士学位论文NOX1，NOX2，NOX4，NOX5的表达在糖尿病并发症，包括血管，视网膜，肾，和外周神经的靶器官被识别[17]。此外实验证据表明，在肾脏内，NOX1，NOX2，NOX4和NOX5同种型在肾小球细胞中表达，包括肾小球系膜细胞，血管平滑肌细胞，内皮细胞，足细胞，肾小管上皮细胞（近端和远端肾小管细胞）和间质细胞成纤维细胞[17,18,19]。在基础水平，ROS可能作为第二信使影响氧化还原敏感的信号转导途径。然而，在DN的病理条件下，ROS的NOX依赖性过量产生导致肾中氧化还原稳态的不平衡。慢性高血糖症以及各种糖尿病相关刺激（包括AGEs，AngII和TGF-β）参与增加各种NOX同种型（包括NOX1，NOX2，NOX4和NOX5）的表达和活性，从而产生过量的ROS，造成对肾组织的氧化损伤[20,21,22,23]。Sonta等人研究发现血管紧张素II1型受体阻滞剂奥美沙坦降低链脲霉素诱导的糖尿病小鼠中NOX4的表达和氧化应激水平。NAD（P）H氧化酶4型（Nox4）为TGF-β1驱动的纤维化反应中发挥关键作用的分子[24]。大量文献报道NADPH氧化酶是正常和病理状态下肾中活性氧物质（ROS）的主要来源。在NADPH氧化酶亚型中，NADPH氧化酶4、2（Nox4、2）在肾中高度表达，在糖尿病肾病、慢性肾脏病和急性肾损伤等基础和病理状态下都参与了肾脏ROS的产生[25,26,27,28]并且在DN发生发展中起重要作用。近年来的研究发现抑制Nox4的表达能够能够有效的缓解DN的肾脏损伤[29,30]。研究表明AngII通过AT1R产生ROS，从而激活JNK，TGF-β1，NF-κB和AMPK,诱导炎症反应[31]。在病理生理环境中，AT1R受体激活与各组织氧化应激和纤维化进展的程度密切相关。可通过调控AT1R改变血管紧张素II对机体功能的调节，其调控方式包括局部调节AT1R受体的表达、受体脱敏和受体的内生化[32]。本研究结果显示20周龄2型糖尿病db/db小鼠肾皮质中ARAP1、AT1R的表达显著升高，增强AT1R对血管紧张素II的敏感性进一步促进NOX4、2的表达，引起氧化应激的亢进，和促进TGF-β1、FN和COIIV的表达，导致肾脏的纤维化病变。靶向抑制体外高糖培养的系膜细胞中ARAP1的表达，减少了AT1R的表达量，减轻细胞外基质分泌产生。乌索酸及其类似物具有抗炎、抗癌、抗氧化、降低血糖和血脂作用而被广泛的应用于治疗各种癌症、炎性疾病、糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病、乙型肝炎和丙型肝炎等疾病[33]。ZHOU等人研究发现口服低剂量乌索酸通过抑制STAT-3，ERK1/2和JNK信号通路的激活，以及抑制iNOS过表达，显著改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾小球肥大和细胞外基质增多[34]。Qi等人研究表明乌索酸可25 中国医科大学硕士学位论文以可显著降低糖尿病小鼠模型的血糖，血尿素氮（Bloodureanitrogen，BUN），血清肌酐（Creatinine,Cr）以及超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6），改善糖尿病肾脏损伤[35]。有报道称发现膳食中补充乌索酸能够改善血糖和血脂水平，降低血脂在肝脏中积累，并增加抗氧化酶活性在代谢疾病的啮齿动物模型[36]。本研究表明乌索酸可显著降低2型糖尿病db/db小鼠体重、血糖和尿微量白蛋白/肌酐比率，降低db/db小鼠肾脏中ARAP1、AT1R、NOX4、2及TGF-β1的表达，减少系膜基质增生和细胞外基质蛋白聚集，减轻肾小球基底膜不均匀增厚，减轻氧化应激反应，缓解糖尿病肾病肾脏的损伤。26 中国医科大学硕士学位论文5结论1、2型糖尿病db/db小鼠肾皮质以及体外高糖培养的系膜细胞中ARAP1表达升高促进AT1R的表达升高，增强AT1R对AngII的敏感性进一步促进NOX4、2的表达，引起氧化应激的亢进，促进TGF-β1、FN和COIIV的表达，导致肾脏的纤维化病变。2、靶向抑制系膜细胞中ARAP1的表达减少AT1R的表达，减轻细胞外基质分泌产生。3、乌索酸可显著降低糖尿病db/db小鼠体重、血糖和尿微量白蛋白/肌酐比率，降低db/db小鼠肾脏中ARAP1、AT1R、NOX4、2及TGF-β1的表达，减少系膜基质增生和细胞外基质蛋白聚集，减轻肾小球基底膜不均匀增厚，减轻氧化应激反应，缓解糖尿病肾病肾脏的损伤。27 中国医科大学硕士学位论文本研究创新性的自我评价DN是一种复杂的多基因疾病，累积的基因效应与环境因素互相作用导致DN的发生。在发达国家，DN已成为终末期肾脏病（Endstagerenaldisease，ESRD）的首要原因；在我国，DN在ESRD病因中所占比例逐年上升。近年来的研究表明RAS系统在DN的发生发展中起到至关重要的作用。ARAP1是RAS系统的一个成员，它结合AT1R的C-端区域，可促进受体循环到细胞膜，增加AT1R对血管紧张素II的敏感性。但是其在DN中的作用尚未见报道。本研究发现2型糖尿病db/db小鼠肾皮质以及体外高糖培养的系膜细胞中ARAP1表达升高促进AT1R的表达升高，增强AT1R对AngII的敏感性进一步促进NOX4、2的表达，引起氧化应激的亢进。促进TGF-β1、FN和COIIV的表达，导致肾脏的纤维化病变。靶向抑制系膜细胞中ARAP1的表达减少AT1R的表达，减轻细胞外基质分泌产生。乌索酸可显著降低糖尿病db/db小鼠体重、血糖和尿微量白蛋白/肌酐比率，降低db/db小鼠肾脏中ARAP1、AT1R、NOX4、2及TGF-β1的表达，减少系膜基质增生和细胞外基质蛋白聚集，减轻肾小球基底膜不均匀增厚，减轻氧化应激反应，缓解糖尿病肾病肾脏的损伤。28 中国医科大学硕士学位论文参考文献[1]ShawJE,SicreeRA,ZimmetPZ.Globalestimatesoftheprevalenceofdiabetesfor2010and2030.DiabetesResClinPract,2010,87(1):4–14[2]EvangeliaD,AnilaD,KonstantinosL,etal.ImprovementsintheManagementofDiabeticNephropathy.Spring-Summer,2015,12(1-2):119–133.[3]FukudaA,WickmanL,VenkatareddyM,etal.AngiotensinIIdependentpersistentpodocytelossfromdestabilizedglomerulicausesprogressionofendstagekidneydisease,KidneyInt.2012,81:40-55[4]ColafellaKM,HilliardLM,DentonKM.Epochsinthedepressor/pressorbalanceoftherenin–angiotensinsystem[J].ClinSci(Lond),2016,130(10):761-771.[5]GuoDF,ChenierI,TardifV,etal.Type1angiotensinIIreceptor-associatedproteinARAP1bindsandrecyclesthereceptortotheplasmamembrane.BiochemBiophysResCommun,2003;310(4):1254–1265.[6]GuoDF,ChenierI,TardifV,etal.Type1angiotensinIIreceptor-associatedproteinARAP1bindsandrecyclesthereceptortotheplasmamembrane.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2003,310(4):1254-1265.[7]LeeCH,WuSL,ChenJC,etal.EriobotryaJaponicaleafanditstriterpenesinhibitedlipopolysaccharide-inducedcytokinesandinducibleenzymeproductionviathenuclearfactor-kappaBsignalingpathwayinlungepithelialcells.AmJChinMed,2008,36:1185-1198.[8]LiuJ.Pharmacologyofoleanolicacidandursolicacid.JEthnopharmacol,1995,49:57-68.[9]NinichukV,ClaussS,KulkarniO,etal.LateonsetofCCl2blockadewiththeSpiegelmermNOX-E36e30PEGpreventsglomerulosclerosisandimprovesglomerularfiltrationrateindb/dbmice,Am.J.Pathol,2008,172;628-637.[10]RahimiZ.Theroleofreninangiotensinaldosteronesystemgenesindiabeticnephropathy.Can.J.Diabetes,2016,40;178–183.[11]BakrisGL,WilliamsM,DworkinL,etal.Preservingrenalfunctioninadultswithhypertensionanddiabetes:aconsensusapproach.NationalKidneyFoundationHypertensionandDiabetesExecutiveCommitteesWorkingGroup.AmJKidneyDis,2000,36:646–661.[12]BrennerBM,CooperME,ZeeuwD,etal.Effectsoflosartanonrenalandcardiovascularoutcomesinpatientswithtype2diabetesandnephropathy.NEnglJMed,2001,345:861–869.29 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中国医科大学硕士学位论文[26]GorinY,WauquierF.UpstreamregulatorsanddownstreameffectorsofNADPHoxidasesasnoveltherapeutictargetsfordiabetickidneydisease.MolCells,2015,38(4):285–96.[27]GorinY.Nox4asapotentialtherapeutictargetfortreatmentofuremictoxicityassociatedtochronickidneydisease.Kidneyinternational,2013,83(4):541–3.[28]MengXM,RenGL,GaoL,etal.NADPHoxidase4promotescisplatin-inducedacutekidneyinjuryviaROS-mediatedprogrammedcelldeathandinflammation.LabInvest.2018Jan;98(1):63-78.[29]CuiY1,ShiY1,BaoY1,etal.Zingeroneattenuatesdiabeticnephropathythroughinhibitionofnicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase4.BiomedPharmacother.2018Mar;99:422-430.[30]WanRJ1,LiYH1.MicroRNA-146a/NAPDHoxidase4decreasesreactiveoxygenspeciesgenerationandinflammationinadiabeticnephropathymodel.MolMedRep.2018Mar;17(3):4759-4766.[31]NamiK,YoungaeJ,MisoN,etal.AngiotensinIIaffectsinflammationmechanismsviaAMPK-relatedsignallingpathwaysinHL-1atrialmyocytes.SciRep,2017,7:10328.[32]CastropH,HocherlK,KurtzA,etal.Physiologyofkidneyrenin.PhysiolRev,2010,90(2):607–673.[33]HidayatHB,IvanRG,IftikharA,etal.Ursolicacidderivativesforpharmaceuticaluse:apatentreview(2012-2016)EXPERTOPINIONONTHERAPEUTICPATENTS,2017,27(9):1061–1072[34]ZhouY,LiJS,ZhangX,eta1.Ursolicacidinhibitsearlylesionsofdiabeticnephropathy[J].IntJMolMed,2010,26(4):565-570．[35]QiMY,YangJJ,ZhouB,eta1.Studyontheprotectiveeffectofursolicacidonalloxan-induceddiabeticrenalinjuryanditsunderlyingmechanisms.Medline,2014,30(5):445-8.[36]JayaprakasamB,OlsonLK,SchutzkiRE,etal.Ameliorationofobesityandglucoseintoleranceinhigh-fat-fedC57BL/6micebyanthocyaninsandursolicacidinCorneliancherry(Cornusmas).JAgricFoodChem,2006,54:243–248.31 中国医科大学硕士学位论文综述血管紧张素II1型受体相关蛋白功能研究进展摘要：血管紧张素II（AngiotensinII，AngII）作为肾素-血管紧张素系统（renin–angiotensinsystem，RAS）主要的调节效应因子，其与血管紧张素II1型受体（AT1R）结合后，发挥其在体内调节电解质平衡，血管收缩，调节血压，促进心肌细胞增殖及腹膜纤维化，肾小管近端小管上皮细胞增殖及肾小球硬化，参与糖尿病肾病，高血压，肿瘤的发生发展。最近的研究报道称，AT1R相关蛋白特异性的结合在AT1R的羧基末端，通过调节受体的内化，细胞膜的在通及增加受体的敏感性等作用发挥其对受体表达的调控作用。本篇文章的重点在于介绍AT1R相关蛋白家族中的两个主要成员血管紧张素II1型受体相关蛋白（AngiotensinIItype1receptor(AT1R)–associatedprotein，ATRAP）及血管紧张素II1型受体相关蛋白1（AngiotensinIItype1receptor-associatedprotein1，ARAP1）相关研究进行综述，为RAS系统的进一步研究提供依据。关键词：血管紧张素II1型受体相关蛋白血管紧张素II1型受体相关蛋白1RAS系统在调节血压，钠水平衡，和自主神经系统的活动中起着核心作用，其存在于体内的不同组织中发挥着不同的作用[1,2]。AngII是RAS的关键生物活性分子，是通过血管紧张肽原蛋白水解加工后将局部的肾素分解为AngI，随后在血管紧张素转换酶（angiotensinconvertingenzyme，ACE）的作用下由AngI转化为AngII。AngII在心血管系统中的作用主要是通过AT1R介导[3]。AT1R是典型的G蛋白偶联受体（GPCR）家族成员，其结构特征在于具有七个跨膜结构域[4,5,6]。AngII与AT1R的结合依赖于AngII的Tyr4（酪氨酸）或Phe8（苯丙氨酸）。已经显示出几种蛋白质参与在AT1R作用的分子机制中，均特异性的结合在AT1R的羧基末端，通过调节AT1R在细胞内的运输，细胞膜的表达，受体的敏感性发挥生物学作用。本文就ATRAP及ARAP1两种AT1R相关蛋白的研究进展综述如下。1.1ATRAP结构与分布Daviet等人[7]以鼠AT1R胞质区羧基末端为诱饵，使用酵母双杂交技术从小鼠肾脏cDNA文库筛选出一个特异性的耦联蛋白，其开放阅读框为483个碱基对，预测分子量为18kDa，命名为ATRAP。ATRAP为跨膜蛋白质定位在细32 中国医科大学硕士学位论文胞内运输囊泡和质膜。ATRAP在氨基末端包含有三个疏水结构域：氨基酸残基的蛋白质14-36,55-77和88-108和一个亲水细胞质羧基末端:氨基酸残基109-161。第一个跨膜域由非极性和极性氨基酸残基的混合物组成;第二和第三跨膜结构域是主要由具有一些极性氨基酸残基的疏水性残基组成。内源性转染的ATRAPcDNA显示颗粒分配;电子显微镜显示存在ATRAP在突出的核周囊泡膜上;并通过免疫荧光共定位分析显示ATRAP共定位于对应内质网的细胞内囊泡隔室中，高尔基体和内吞囊泡。实时跟踪ATRAP囊泡显示组成性易位朝向质膜[8]。ATRAP被观察到表达在主动脉，心脏，肾脏，血管平滑肌细胞和脂肪组织，最强烈的表达在肾脏。1.2ATRAP的功能ATRAP是一种AT1R结合蛋白，它可能有选择性通过促进AT1R内化下调AT1R介导的信号传导。在心血管系统中AT1R和ATRAP的不平衡与高血压和心脏重塑的发生发展密切相关。转基因模型增加肾ATRAP超过基线的表达同时伴随着一个组成性的肾脏质膜上AT1R的表达减少，肾脏AT1R的内化受到促进作用以及减少诱导血管紧张素原基因表达对AngII的反应[9].此外，另一项研究也显示ATRAP在小鼠中的遗传缺陷引起了AT1R在肾脏中的表面表达增强，这一结果与上述结果相一致[10]。研究表明ATRAP能够增强AT1R内化，随之减弱AT1R信号通路通过与AT1R的C末端细胞质结构域受体特定的相互作用[11,12]，但它不与AT2受体相互作用，包括m3毒蕈碱受体，缓激肽B2受体，内皮素ETB受体或β2-肾上腺素能受体受体。然而，ATRAP有可能可以直接影响各种AT1R介导的信号通路，并有报道，核转录因子激活T细胞（nuclearfactorofactivatedT，NFAT）因子，是通过磷酸酶钙调磷酸酶去磷酸化激活，从而被钙信号调节器和亲环蛋白结合激活蛋白质，钙调亲环蛋白配体（CAML）激活[13]。有人表示在心肌细胞，内皮细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）中存在AngⅡ通过AT1R信号传导引起的病理生理改变[14]。几个发现已经表明由AngII诱导的钙调磷酸酶/NFAT信号通路调节细胞生长和心血管肥大，有助于病理性心血管重塑[15]。该CAML已经被证明是ATRAP的合作伙伴，也是N终端CAML的亲水结构域（氨基酸残基1-189）介导ATRAP和CAML之间的特定相互作用。该ATRAP的氨基酸残基40-82有助于这种相互作用的结合。功能上，ATRAP的过度表达降低了AngII介导的CAML诱导的钙调磷酸酶-NFAT的活化通路并抑制心肌细胞肥大反应和V33 中国医科大学硕士学位论文SMC衰老过程[16]这些结果表明ATRAP显着促进了组织AT1R的内化和进一步削弱某些AngII介导的病理反应在心血管和肾细胞中。一种转基因模型小鼠增加全身ATRAP表达，炎性血管明显的衰减重建袖套损伤介导的动脉粥样硬化病变[17]。还生产了心脏特异性的ATRAP转基因小鼠检查ATRAP可能的心脏保护作用[18]。过表达ATRAP基因，显着降低AT1R的数量，心肌细胞表面的受体也是如此，从而降低p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化的程度以及c-fos启动子的活性，减少了AngII刺激下的心肌细胞蛋白质的合成。证据表明转化生长因子-β（TGF-β）是一种必不可少的组成部分之一，在AngII诱导心肌重塑和纤维化细胞内信号传导途径[19]，并可能参与了高血压的发病机制[20]。TGF-β发挥多效性，并可以积极和消极调节细胞的凋亡，迁移和合成细胞外基质蛋白如纤维连接蛋白和血管平滑肌细胞中的胶原蛋白。TGF-β在心血管疾病发展中起着关键作用，包括高血压。因此，我们研究了的TGFβ-参与ATRAP对血管平滑肌细胞影响作用。过度表达ATRAP抑制AngII介导的TGF-βmRNA的表达增加和TGF-β蛋白的产生，效果与缬沙坦预处理一样，一种AT1R拮抗剂[21]。此外，内膜增生是颈动脉损伤后再狭窄的主要原因，其作用机制涉及血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖和迁移。据报道，血管紧张素II1型受体相关蛋白（ATRAP）通过抑制VSMCs增殖和迁移而抵抗内膜增生;使用腺病毒介导的ATRAP过表达可以诱导VSMC凋亡，缓解气囊损伤引起的大鼠新生内膜形成。在血管紧张素Ⅱ刺激条件下，ATRAP过表达通过抑制PI3K-Akt信号通路诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡;而通过PTEN抑制剂上调Akt则消除了凋亡的死亡。因此，ATRAP通过控制PI3K-Akt信号介导的VSMC凋亡来调节颈动脉内膜增生[22]。过度表达ATRAP抑制AngII诱导增加血管平滑肌的细胞增殖。这些结果显示ATRAP显着促进AT1R的内化进一步减弱某些AngII介导的重构在心血管细胞中的反应。据报道，ATRAP在抑制慢性肾病小鼠残肾模型中的高血压方面起着关键作用。在C57BL/6和129/Sv小鼠的肾中5/6肾切除检测对内源性ATRAP表达的影响。虽然具有残余肾的129/Sv小鼠显示肾ATRAP表达降低并且发展为高血压，但是C57BL/6小鼠表现出增加的肾ATRAP表达和对进行性高血压的抵抗。有趣的是，在ATRAP敲除小鼠中，在高血压抗性C57BL/6背景中的5/6肾切除导致血浆容量增加的高血压。此外，与5/6肾切除术后的野生型C57BL/6小鼠对比，在敲除的情况下，上皮钠通道α亚基和肿瘤坏死因子-α的肾表达显着增强，伴随着增加的膜血管紧张素II1型受体的表达在肾。因此，肾脏AT34 中国医科大学硕士学位论文RAP下调涉及肾脏减量引起的血压升高的发作和进展，并且暗示ATRAP作为慢性肾病中高血压的治疗靶标[23]。Wakui等人研究发现，ATRAP的远端小管显性增强抑制病理性肾钠重吸收和响应HS负荷的血压升高。这些发现表明，ATRAP介导的肾脏远端小管钠处理的调节可能是盐敏感性高血压调节机制[24]。然而对ATRAP的病理生理作用的进一步研究发现，功能性肾素-血管紧张素系统（RAS）存在于脂肪组织中。脂肪组织RAS被提议用于代谢紊乱的病理生理学。在高脂喂养的SHR(自发性高血压)大鼠中存在肥胖，血脂异常，高血糖，异常脂肪因子分泌，但在氯沙坦处理的大鼠中上述指标减弱。高脂喂养的SHR大鼠脂肪组织中AT1R亚型a（AT1aR）和启动子甲基化表达升高被氯沙坦逆转。在高脂喂养的SHR的脂肪组织中证实ATRAP的表达和启动子甲基化降低。然而，氯沙坦对ATRAP的表达和启动子甲基化没有影响。在脂肪组织中通过DNA甲基化的AT1aR和ATRAP表达的差异表观遗传调节可能涉及长期有益效果[25]。脂肪组织是一个复杂的器官，不仅储存过多的能量，而且还有许多调节全身能量的脂肪因子。脂肪组织功能障碍导致代谢紊乱，如胰岛素抵抗，高血压，心血管疾病。最近的研究发现，使用一个脂肪组织中过度表达血管紧张素II1型受体相关蛋白（ATRAP）的小鼠模型。在健康饮食下，ATRAP转基因（TgATRAP）小鼠显示与野生型对照（WT）相似的体重，脂肪量和胰岛素敏感性。当用高脂饮食挑战时，与WT相比，TgATRAP小鼠改善了胰岛素敏感性，降低了脂肪量。脂肪细胞褐变和血管生成在TgATRAP小鼠中增加。ATRAP的过表达诱导脂肪组织和原代脂肪细胞中的脂联素表达。脂肪中ATRAP在预防代谢紊乱中具有重要作用，脂联素可能影响脂肪中ATRAP的表达[26]。Ohki等人研究发现棕色脂肪中的ATRAP不影响饮食性肥胖或代谢紊乱的发病机理。在白色脂肪中调节ATRAP的表达对于评估其在肥胖相关代谢紊乱发展中的体内功能是必要的[27]。因此，脂肪组织ATRAP被认为是治疗内脏肥胖的有效治疗靶点[28]。研究表明ATRAPmRNA在健康受试者的白细胞（主要是粒细胞和单核细胞）中大量表达。86例门诊非小细胞肺癌患者外周血白细胞ATRAPmRNA水平与粒细胞和单核细胞计数及血清C反应蛋白水平呈正相关。此外，白细胞ATRAPmRNA与非传染性疾病患者白细胞中白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-αmRNA水平显着相关。另外，与注射脂多糖后的野生型嵌合小鼠相比，骨髓ATRAP缺陷嵌合小鼠中的白细胞白细胞介素-1βmRNA水平显着上调。结论这些结果提示白细胞ATRAP是一种能够反映全身和白细胞炎症特征的新兴标记物，在非发病机制的病35 中国医科大学硕士学位论文理生理过程中起着抗炎因子的作用[29]。这些结果表明，ATRAP可能是治疗高血压、心血管、内脏肥胖和肾脏损伤的一个新的分子靶点。因此需要进一步阐明ATRAP组织特异性调控的分子机制和在生理及病理条件下ATRAP基因表达水平及活性改变的相关机制。2.1ARAP1结构与分布郭等人利用酵母双杂交系统发现在AT1A受体（残基318-359）羧基末端区域存在一个与其相互作用的新基因，将其命名为ARAP1(血管紧张素II1型受体相关蛋白1)。随后从kgt11大鼠VSMCcDNA中分离出全长2138bp的大鼠ARAP1cDNA通过使用小鼠克隆A11作为探针的文库。假定ARAP1的一个起始密码子为ATG，从腺嘌呤389开始，之前是共有的Kozak序列，AGGACCATG[30]，以及一个1479bp的开放阅读框编码一个含有493个氨基酸残基的亲水蛋白，其分子量为57,156Da。体外翻译的流动性产物与预测ARAP1分子量一致。10bp聚（A）尾和聚腺苷酸化信号AAUAAA序列被确定在30-的翻译终点。ARAP1蛋白质包含一段丰富的脯氨酸在蛋白质的中间,这可能会与Src同源3（SH3）结构域中包含的蛋白相互作用[31]。氨基酸序列数据库搜索显示ARAP1（残基95-202）108个氨基酸与酵母PEP12没有任何间隙具有20％同源性的区域。酵母PEP12蛋白定位于前液泡内体中，它的活性是运输蛋白质从高尔基到液泡体内所必需的[32,33]。这一点表明ARAP1可能在大鼠细胞的AT1R分选中起作用。ARAP1（残基272-487）216个氨基酸残基和纤维蛋白原之间的216个氨基酸残基具有43％相同性的区域。ARAP1在心脏，脑，肺，肝，睾丸和肾中表达，但心脏中的表达最为丰富。在培养的大鼠VSMC，人HEK-293细胞，猴肾细胞Cos-7细胞系和小鼠成纤维细胞系NIH3T3中也检测到ARAP1mRNA的表达。2.2ARAP1的功能ARAP1是RAS系统的一个成员，它结合AT1R的C-端区域，可促进受体循环到细胞膜，增加AT1R对血管紧张素II的敏感性，激活RAS系统[34]。肾脏的ARAP1蛋白的表达仅限于脉管系统和肾小球系膜细胞。ARAP1表达在小鼠肾小球系膜细胞，肾小球系膜细胞高度表达AT1R和AngII共同参与肾小球系膜细胞生长和分泌细胞外基质蛋白质，包括胶原和纤维连接蛋白。ARAP1可以通过调控AT1R的表达从而参与调控其下游的磷脂酶Ｃ、蛋白激酶、酪氨酸激酶/磷酸酶、Rho激酶、NADPH氧化酶衍生物和活性氧的产生，进一步调节高血压血管36 中国医科大学硕士学位论文表型的改变[35]。体内使用转基因小鼠，在近端小管中过度表达Arap1，Arap1转基因小鼠表现为盐敏感和血管紧张素II依赖性高血压,且伴随着明显的肾脏肥大[36]。这些数据表明Arap1增强AT1依赖性肾脏信号传导。有文献报道患有内毒素血症的小鼠血压明显降低，虽然其体内的AngII浓度是增加的，但是ARAP1和AT1R的表达是明显减少的。在体外环境用促炎症因子对系膜细胞进行干预后，系膜细胞中ARAP1和AT1R的表达均明显减少，但是在给予血管紧张素转换酶抑制剂后，其表达有所增加[37]。PAN等人研究发现Xuebijing通过促进Arap1的表达抑制NF-κB信号通路的激活和释放促炎细胞因子，从而缓解中暑引起的低血压反应在大鼠体内[38]。这些结果表明，ARAP1在心血管疾病的发生发展中起到重要作用，因此需要进一步的阐明其在生理和病理条件下的调控机制及表达变化。3.结语自从发现肾素以来的100多年，对RAS的基础研究继续解开其在正常生理和疾病中的更多的新功能。AT1R是RAS系统作用的主要靶点，AT1R相关蛋白的表达可以促进或抑制细胞表面AT1R的表达，从而影响其上下游的信号转导。特别是最近几年发现RAS系统在胰腺炎，糖尿病，囊性纤维化和胰腺癌形成的发病机制中扮演重要角色，且有报道称RAS系统在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤的发生发展、细胞及血管的生成、增殖、迁移等方面发挥重要作用，更有研究表明AT1R相关蛋白在肿瘤组织中表达，但其具体的作用机制研究不够全面，因此需进一步阐明这些AngII受体相关蛋白在生理及病理组织中的功能调节作用，包括磷酸化和去磷酸化，转录控制和寻找可能的配体，及其信号转导、数量和功能的变化。这有助于RAS系统更全面更具体的研究，从而发现新的药物作用靶点，最终应用于临床疾病的治疗中。37 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中国医科大学硕士学位论文致谢研究生的学习生活在毕业论文完成的这一刻划下句点。这三年的学习生活使我受益颇多。回首这三年来，每周的文献超读、紧迫的实验设计和过程、整理数据、解决技术问题、实验结束、撰写论文、修改论文直至最终完成，我得到了非常多的帮助和关怀，在此要向他们表达我最诚挚的感谢。首先，我要感谢我的导师范秋灵教授，感激她的无私、高质量的悉心教导及关怀，及在临床工作中的悉心指导和大力支持。从老师身上，我学到的不仅仅是实验的技巧，更重要的是正确的科研思维和做人的道理。我还要衷心感谢汪旭老师，在实验设计方面给予我的技术指导和无私的援助。感谢中国医科大学中心实验室陈洋老师、于淼老师、陈冬老师、都姝妍老师及于爽老师在实验操作和仪器使用方面给予我的帮助。同时也感谢这两年来与我互勉互励的同学和朋友们，感谢徐莉、曹旭、赵雪、李露露等师姐师妹，感谢你们给予我的热情帮助和支持。感谢答辩委员会各位老师的悉心指导，及研究生院的老师们的指导和帮助。最后深深感谢我的父母，是您们对我无私的爱使我终于完成了二十一年的寒窗生涯！我将在今后的工作、学习、生活中加倍努力，再次感谢你们，祝你们一生健康、快乐!42 中国医科大学硕士学位论文个人简历姓名：鲁伶旭性别：女出生年月：1991年5月5日民族：汉族籍贯：辽宁专业：肾脏病学导师：范秋灵教授学习经历：2007年9月-2010年6月抚顺市第十二中学2010年9月-2015年7月锦州医科大学临床医学五年制本科2015年9月-2018年7月中国医科大学附属第一医院肾脏病学学术硕士43