中间丝蛋白nestin在糖尿病肾病发病中的作用及机制研究

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1、河北医科大学博士学位论文中间丝蛋白Nestin在糖尿病肾病发病中的作用及机制研究姓名：刘巍申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：段惠军201204中文摘要、中间丝蛋白Nestin在糖尿病肾病发病中的作用及机制研究摘要目的：糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，也是糖尿病患者致残与死亡的重要因素之一。DN的主要病理特征是肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚，肾小球硬化及肾间质纤维化。近几年的研究显示，肾小球滤过屏障结构和功能的改变，尤其是作为肾小球滤过屏障重要组成

2、成分的足细胞损伤，在糖尿病肾病的进展中发挥了重要作用。足细胞附着于肾小球基底膜外侧，是一种高度特异性的终末分化细胞，参与构成肾小球滤过屏障的最外层，对蛋白的滤过及维持滤过屏障成分的更新起着举足轻重的作用。在DN的发生发展中，足细胞的病理改变主要包括正常形态消失、胞体肥大或萎缩、空泡化、胞浆中脂滴形成、足突增宽融合、足细胞数目减少等。但是，足细胞损伤的具体机制尚不清楚，有研究显示，细胞骨架蛋白的改变参与了足细胞的损伤过程。Nestin是一种属于第Ⅵ类中间丝的细胞骨架蛋白，表达于多种组织的干细胞或前体细胞中，被广泛用作干细胞的标志性蛋

3、白。除维持细胞的正常形态，nestin还具有抗凋亡作用。抑制细胞中nestin的表达，可以增强过氧化氢(I-1202)刺激诱导的神经前体细胞和血管平滑肌细胞的凋亡，而将野生型的nestin(nest-1893)转入到细胞内可起到保护作用，显著减少H202诱导的细胞凋亡。研究发现，nestin表达于鼠和人发育成熟的肾脏足细胞中，对维持足细胞的形态和功能具有重要作用。抑制nestin的表达，能显著降低体外培养足细胞足突的数量。而在IgA肾病、局灶阶段性肾小球硬化等肾脏疾病中，nestin表达的降低同蛋白尿密切相关。在糖尿病肾病中，ne

4、stin表达的情况目前尚未有明确报道。在糖尿病肾病中，足细胞凋亡是引起肾小球足细胞数目减少、肾组织损伤、蛋白尿和肾功能降低的重要原因。Nestin在糖尿病足细胞损伤和凋亡过程中起何种作用目前尚不清楚。本研究拟通过建立糖尿病大鼠模型和体外培养条件性永生化足细胞，探讨nestin在糖尿病肾小球足细胞损伤中文摘要中的作用及机制，为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制及其防治提供理论依据。方法：1中间丝蛋白Nestin在糖尿病大鼠肾组织的表达Wistar大鼠随机分为2组：对照组(Contr01)和糖尿病组(Diabetesmellitus，DM

5、)。DM组大鼠按65megkg体重腹腔注射STZ(溶于O．1M的无菌柠檬酸．柠檬酸钠缓冲溶液，pH4．5)，对照组大鼠注射等量的柠檬酸．柠檬酸钠缓冲溶液。48h后测定血糖和尿糖，血糖>16．7mmol／L且尿糖阳性者(H十卅)作为糖尿病(DM)大鼠。分别于成模后4、8、12、16周，每组各取5只大鼠，留取24h尿液和血清后，处死大鼠切取肾脏。部分肾组织分别置于4％多聚甲醛和4％的戊二醛固定液中固定，用于光镜、免疫组织化学和电镜检测；部分肾脏皮质用于分离肾小球，提取肾小球总RNA和蛋白。免疫组织化学和Westernblot检测肾小球

6、内nestin、P．nestin、vimentin、CalkS／p35蛋白的表达；免疫荧光双染色检测nestin与vimentin、Cdk5、WTl、a-SMA、synaptopodin、laminin等的共同表达情况；免疫共沉淀检测nestin与vimentin蛋白的结合情况；Real．timePCR检测肾小球中nestin、vimentin和Cdk5mRNA的表达。2高糖对体外培养小鼠足细胞Nestin表达的影响条件性永生化足细胞在33℃，1,-IFN存在的许可条件下培养传代后，于37℃，无?-IFN韵非许可条件下培养lO．1

7、4天，促进细胞分化成熟。免疫荧光化学检测synaptopodin观察足细胞成熟情况。取培养10天后的足细胞，分成3组：正常糖组(5．5mM，Normalglucose，NG)；正常糖+甘露醇组(5．5mMglucose+24．5mMmannitol，N洲)；高糖组(30mM，Highglucose，HG)。分别刺激6、12、24、48、72h后收集3组细胞，提取细胞总蛋白和总RNA。采用免疫细胞化学检测nestin、vimentin、Cdl(5在足细胞中的表达；免疫荧光双染色和免疫共沉淀检测nestin与vimentin的共表达情

8、况；Westernblot检测nestin、p-nestin、vimentin、Cdk5／p35的表达；Real-timePCR检测nestin、vimentin和Cdk5的mRNA水平。3抑制Cdk5对高糖刺激足细胞Nestin表达的影响①动物实