肿瘤细胞凋亡交流

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1、一、细胞凋亡的形态学检测1光学显微镜和倒置显微镜　　（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。　　常用的DNA特异性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三

2、种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10ug/ml。Hoechst33258染色1．原理Hoechst33258和Hoechst33342均为非嵌人性荧光染料。它们在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为DNA探针。Hoechst33342和Hoechst33258均

3、可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechsr-DNA的激发和发射波长分别550nm和460nm。在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。2．溶液的配制(1)Hoechst33258储存液Hoechst33258lmg0．01mol／LPBS(pH7．4)5ml(2)Hoechst33258工作液(终浓度为0．5ug／ml)Hoechst33258浓缩液125ul0．01mol／LPBS(pH7．4)50ml3．操作程序(1)细胞悬液或培养单层细胞等标本，用醋酸—乙醇或Carnoy固定液固定；(2)0．01mol／L

4、PBS漂洗5分钟；(3)Hoechst33258工作液染色，室温15分钟；(4)0．01mol／LPBS漂洗3次，每次5分钟；(5)用甘油与PBS比例为1：9的混合液或水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。结果：该染料为DNA的特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10ug/ml。　　结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的

5、染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。　　3透射电子显微镜观察　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体一、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）　　磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细

6、胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。　　碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。　

7、　方法　　1悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。　　2贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。　　3爬片细胞染色：同上

8、，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。　　结果[图4、图5]　　注意事项　　1.整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。　　2.操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。图4－