栉孔扇贝血细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆研究

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1、中国海洋大学博士学位论文栉孔扇贝血细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆姓名：马洪明申请学位级别：博士专业：水产养殖指导教师：麦康森20040609{§甜。扇9l】R嘲l胞形态学埘究和抗捐功能堆㈥的克降栉孔扇贝血细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆捅姜栉孑L扇贝(Chlamys／a，Mrf)是我国北方重要的海水养殖种类。近年来频发的病害和大规模死亡给栉孔扇贝养殖业造成了巨大的损失。贝类的免疫防御手要依靠血细胞的吞噬作用和血淋巴中各种非特异的免疫活性因子的识别、调节和杀伤等作_}_}j。大多数学者将双壳贝类的血细胞分

2、为两类：粒细胞和透明细胞。在一些种类也发现三种以上的血细胞。贝类体液中的非特异免疫防御因予目前发现的包括调理素、抗菌肽、类细胞因子样物质等。由于贝类没有基于淋巴细胞和抗体的获得性免疫机制，血细胞和非特异的体液因予构成了贝类抵抗病害感染的主要防线。本文研究了栉孔扇贝血细胞的形态，并尝试对体液免疫活性因子基因进行了克隆和筛选。利用显微镜学和流式细胞术对栉孔扇贝血细胞进行r形态学研究和分类。趣微结构观察显示有三种不同形态的细胞：I型血细胞含有发达的细胞器如线粒体、高尔基体和粗l前内质网，特别是细胞质中含有大量的囊泡

3、结构，细胞器和囊泡结构向核区聚集，形成明显的内质和外质：II型细胞含较少的细胞器和囊泡结构，较为电子透明，细胞器和囊泡在细胞中均匀分布；III型血细胞具有较小的胞体和较大的细胞核，核质比高，几乎不含囊泡和细胞器。没有发现在其他双壳贝类中被广泛报道的粒细胞。注射酵母刺激后，I型血细胞的数目显著增加，细胞质变得更加电子致密；II型细胞的囊泡和细胞器亦有轻微增加；T1I型细胞未见显著变化。流式细胞术(FSCvSSC)显示兰群细胞被清楚地分开：1)颗粒度高的大细胞，2)中等颗粒度的中等大小细胞，3)颗粒度低的小细胞。

4、m淋巴中的平均血细胞数为203二E0．43×107ml／1，三群细胞分别占58O％，24．1％，17．9％。在玻片上充分伸展后，Ifli细胞同样显山3种不同的伸展样式：分别命名为A，B，C型。A型Ⅱ口细胞折光性强，明亮：片状伪足伸展明显，且多从细胞之一端伸出。B型细胞折光性差，较暗；伪足刺突样。C型血细胞较暗，没有明显的伸展。伸展特征、电镜观察和流式细胞术分析的结果互相吻合，据此，可将栉孔扇贝的血细胞分为栉孔扇弛jf}l自11月缒蟛怠学磷究和抗瘸功能揍俐的兜酶三类。q2-巨球蛋白(0．2．Macroglobu

5、lin，02M)是存在于多种动物血浆中的‘类大分子糖蛋白，足重要的非特异免疫因子。作为广谱蛋白酶抑制因子，ct2M通过结合并抑制组织中内源或外源的过量蛋白酶为炎症和感染条件下的组织提供保自、。。et2M还可以广泛地结合多种细胞因子、细菌内毒素、凝集素等分子，通过调节它们的活性参与广泛的免疫防御和调节。c【2M与高等动物补体因子C3、C4、C5的结构相似性提示其可能在溶血过程中行使某种功能。目前已经在多种动物克隆了a2M基因，包括几种节肢动物、线虫等。贝类中也发现了Ⅱ2M活性并在少数种得到了纯化蛋白，尚没有基因

6、克隆的报道。根据a2M不破坏所抑制蛋白酶的活性位点这一特性，利用血浆保护试验，首次证明了在稀孔扇贝和皱纹盘鲍(Hatiotisdiscushannai)中有a2M活性存在。在此工作的基础上，根据a2M序列同源性资料，利用简并引物RT-PCR，PCRWalk以及5’RACE和3’RACE方法克隆了栉孔扇贝Ⅱ2巨球蛋白eDNA全序列(检索号：AY395573)。该基因全长6408bp其中编码区5l57bp，5’端不翻译区18bp，3’端不翻译区1235bp(含polyA尾23bp)。ORF编码1719个氨基酸，其

7、中前16个氨基酸残基为信号肽序列，成熟蛋白质分子量为192KDa，等电点为4．85。与来源于节肢动物鲎(Limuluspolyphemus)的a2M具有最高序列相似性。栉孔扇贝a2M蛋白具有典型的a2M巨球蛋白的保守性结构域。系统发育树分析显示人C3、C4、C5与无脊椎动物a2M具有比脊椎动物ct2M更近的进化距离。三维结构为：6段c【．螺旋构成的内层Ⅸ．螺旋桶和另6段c【．螺旋构成的外层旺．螺旋桶形成a2M的结构核心，少量的p．折叠片和大量D转角位于分子表面。利用RT-PCR方法分析了栉孔扇贝旺2巨球蛋白在

8、不同组织的表达情况。除血细胞外在其他检测组织外套膜、闭壳肌、性腺、肠等均未检出q2M表达。抑制消减杂交(SuppressionSubtractiveHybridization)是筛选差异表达基囚的有效方法。利用该方法筛选了栉孔扇贝血细胞在感染胁迫条件下的差异表达基因。注射1×107酵母菌、大肠杆菌、溶壁微球菌的混合菌液胁迫栉孔扇贝10小时后，分别抽墩处理组和对照组的【f口．细胞RNA反转录成eDNA