栉孔扇贝骨形态发生蛋白2基因的克隆及表达分析.pdf

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1、第43卷第12期2013年12月中国海洋大学学报PERl0DICALOF0CEANUNIVERSITYOFCHINA43(12)：048～055DeC．，2013栉孔扇贝骨形态发生蛋白2基因的克隆及表达分析+封利颖，郭慧慧，李雪，于茜，胡晓丽，张玲玲，王师，包振民“(中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东青岛266003)摘要：骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticprotein，BMP)家族成员在动物的骨骼发育及器官形成中发挥着重要作用。本文利用同源克隆策略获得栉孔扇贝(Chlamys．向r肥一)BMP2基因(CfBMP2)的全长cDNA和基

2、因组DNA序列。其中，DNA序列长度为11252bp，由3个外显子和2个内含子组成；cDNA序列全长3562bp，含有1221bp开放阅读框，编码406个氨基酸，与合浦珠母贝(Pinctadafucata)、长牡蛎(Crassostreagigas)、斑马鱼(Daniorerio)和人(Homosapiens)的同源蛋白相似性分别为67％、51％、59％和57％。运用实时荧光定量反转录PCR技术(qRT_PCR)对CfBMP2基因的时空表达进行分析。结果表明，在栉孔扇贝早期胚胎中几乎检测不到CfBMP2mRNA，从囊胚期开始有少量该基因表达，在原肠胚时期表达量显著上升

3、，至幼虫期表达量又显著下降。除原肠胚外，在检测的其它发育时期，包括受精卵、4细胞期、担轮幼虫、D型幼虫和壳顶幼虫间，CfBMP2基因表达量没有显著差异。在取样的成体组织中均检测到CfBMP2基因的表达。其中，鳃中CfBMP2的表达量显著高于其它组织，外套膜次之。在横纹肌、性腺、肾和消化腺中，CfBMP2表达量较低且在这4种组织间无显著差异。上述研究结果提示，CfBMP2可能参与栉孔扇贝的器官组织发生和壳的生长。关键词：栉孔扇贝；骨形态发生蛋白2；基因克隆；表达分析中图法分类号：$917．4文献标志码：A文章编号：1672—5174(2013)12—048—08转化生长

4、因子口(TransforminggrowthfactorB，TGF-f1)超家族是一组具有结构相关性的多功能细胞因子，目前已发现60多个成员，广泛存在于蠕虫、昆虫、哺乳类等物种中[1‘2]，并参与了如早期胚胎发生时身体的构建，软骨、骨及性器官的形成，组织修复，细胞的增殖、分化、凋亡和迁移，内分泌和免疫功能等[1]多种生物学过程。根据序列相似性和激活的下游通路，TGF-13超家族成员主要分为两大类，一类是TGF-t3／活化素／nodal，另一类是骨形态发生蛋白／生长分化因子／谬勒抑制物质(BMP／GDF／MIS)E33。骨形态发生蛋白(Bonemorphogenetic

5、protein，BMP)是TGF-p超家族中最大的分泌型信号传导分子家族，目前已发现至少20个成员，如脊椎动物中的BMPs，果蝇中的DPP和60A，以及线虫中的daf7等。该家族成员在蛋白结构上既有TGF-p超家族的共性，如C末端有保守的半胱氨酸残基，用于形成正确的二聚体结构；又具有其自身特点，如N末端有较多的碱性氨基酸产生较多正电荷，易于吸附在基质上，诱导骨和软骨的形成[3]。研究表明，BMP家族成员在脊椎动物和无脊椎动物的骨骼发育及器官形成中有重要作用，并能调节多种类型细胞的生长和分化[4‘5]，如诱导成骨、胚胎发育、生殖、肌肉等组织的形成和分化等。其中，BMP2

6、是唯一能单独诱导成骨的因子，对骨骼肌来源的细胞进行转染实验，发现BMP2的表达可有效抑制生肌细胞的分化，同时促进骨细胞的分化[6]。BMP2处理成肌细胞系C2C12lh后，即可诱导成肌细胞分化抑制因子Idl基因的表达，从而抑制成肌细胞的分化[7书]。在胚胎发育过程中，BMP2除了通过诱导生肌基因的表达来促进胚胎肌肉生长外，还可通过诱导细胞凋亡抑制肌肉的生长。如用低浓度的BMP2处理鸡胚，可导致肌肉前体细胞增殖标记基因Pax-3表达上调，从而诱导肌肉的增长；相反，高浓度的BMP2则会诱导鸡胚细胞凋亡，抑制肌肉生长[9]。由于在生长发育中的重要作用，BMP也成为软体动物中

7、研究最广泛的TGF-fl超家族成员。在静水椎实螺和欧洲帽贝等腹足类动物中发现，dp矿BMP2／4在胚胎的壳腺周围表达，提示其可能参与胚胎贝壳区域边界的确定及贝壳形成[10

8、。双壳贝类BMP相关的研究较少，主要集中在牡蛎。刺牡蛎(Saccostreakegaki)中dpp在胚胎壳腺形态的建立过程中可能起重要作*基金项目：国家自然科学基金项目(30972239)；中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室(LMB)开放基金项目；国家科技支撑计划项目(2011队D13806)；中国海洋大学水生生物种质资源标准化及资源共享项目资助收稿日期：2012—12—1