栉孔扇贝基质蛋白cfmsp-1的基因克隆鉴定与功能探究

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1、栉孔扇贝基质蛋白cfMSP-1的基因克隆鉴定与功能探究(申请清华大学理学硕士学位论文)培养单位：生命科学学院学科：生物学研究生：甲干初指导教师：谢莉萍副教授二○一五年五月GenecloningandFunctionalstudiesofthematrixproteincfMSP-1inChlamysfarreriDissertationSubmittedtoTsinghuaUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofPhilosophyInBiologyB

2、yJiaGanchuDissertationSupervisor:AssociateProfessorXieLipingMay,2015摘要摘要栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是重要的经济养殖贝类，其贝壳的形成过程与其生长过程是密不可分的。本论文通过对栉孔扇贝贝壳的矿化相关基因cfMSP-1的克隆、定位与功能研究，旨在进一步探索栉孔扇贝的生物矿化机制，对现有的生物矿化理论也具有重要意义。通过对栉孔扇贝外套膜转录组数据分析，我们克隆了其表达量最高的cfMSP-1，通过RACE技术从外套膜组织中克隆获得cfMSP-1基因的cDNA全长。该基因

3、全长为2912bp，包括一个74bp的5’非编码区,一个2406bp的开放阅读框与一个432bp的3’非编码区。其编码蛋白质的预测分子量约为71.3kDa，理论等电点为3.36，经过信号肽预测分析，其N端含有一个20个氨基酸的信号肽。对不同组织的实时定量RT-PCR检测结果显示，cfMSP-1在外套膜组织中特异性表达，通过原位杂交技术进行精确定位，发现其在外套膜边沿部的外褶和向外边沿部分表达，结合信号肽预测结果，推测cfMSP-1可能由外套膜合成并分泌的基质蛋白。贝壳缺刻损伤引起cfMSP-1基因的表达量迅速上调，并且会持续保持在一个相对较高的表

4、达水平。使用RNA干扰方法特异性敲低cfMSP-1基因的表达水平，同时通过扫描电子显微镜（SEM）观察贝壳簇叶层的形态结构发生明显变。根据上述实验结果推测cfMSP-1在栉孔扇贝贝壳簇叶层的形成中起关键作用。关键词：栉孔扇贝；簇叶层；生物矿化；cfMSP-1ⅠAbstractAbstractChlamysfarreriisasignificantspeciesinaquacultureandfisheryinChina.Inourstudy,weclonedandstudiedthebiomineralization-relatedgene-cf

5、MSP-1.OurresearchcontributedtouncoveringthebiomineralizationmechanismofChlamysfarreri.Inthisstudy,weclonedanacidicprotein(pI=3.36)homologofMSP-1thatwashighlyexpressedinthemantletranscriptomeofthescallopChlamysfarreri,withusingRACEcloning.Wegota2912-bptranscriptcontaininga5’-u

6、ntranslatedregion(UTR)of74bp,anopenreadingframeof2406bp(encodingadeduced802aminoacidprotein)anda3’-UTRof432bp.Thecalculatedmolecularmassofthededucedmatureproteinis71.3kDa.A20-aasignalpeptideispredicted.AtthesametimeRT-PCRandinsituhybridizationshowedthatcfMSP-1wasspecificallye

7、xpressedintheouterfoldofthemantleedgeandpallialpart.TheexpressionlevelofcfMSP-1remarkablyincreasedandthenreducedgraduallytoavaluewhichwas~2-foldhigherthanbasallevelsaftershellnotching.Knock-downexpressionofcfMSP-1inadultsviadsRNAinjectiongaveadisorderedfoliasurface.Bothshelln

8、otchingandRNAiexperimentsindicatedthatcfMSP-1playsanessentialroleint