电穿孔精子介导的华贵栉孔扇贝转基因初步研究

《电穿孔精子介导的华贵栉孔扇贝转基因初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、硕士学位论文题目：电穿孔精子介导的华贵栉孔扇贝转基因初步研究英文题目：Preliminarystudyonelectroporation-aidedsperm-mediatedgenetransferinnoblescallopChlamysnobilis姓名张云学号11508053所在学院理学院导师姓名郑怀平专业海洋生物学学入学日期2015年9月答辩日期2018年6月汕头大学硕士学位论文汕头大学硕士学位论文电穿孔精子介导的华贵栉孔扇贝转基因初步研究Preliminarystudyonelectroporation-aidedsperm-mediat

2、edgenetransferinnoblescallopChlamysnobilis学位申请人：张云导师：郑怀平（教授，博导）专业：海洋生物学答辩委员会主席：邓岳文教授答辩委员会委员：刘贤德教授李升康教授马洪雨教授王树启副教授汕头大学海洋生物研究所中国，汕头，515063汕头大学硕士学位论文学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承

3、担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日汕头大学硕士学位论文汕头大学硕士学位论文摘要华贵栉孔扇贝（Chlamysnobilis）是我国南方海区重要的养殖贝类。华贵栉孔扇贝“南澳金贝”是本课题组

4、培育的富含类胡萝卜素的新品种，其贝壳、外套膜、闭壳肌均为金黄色，而褐色品系是类胡萝卜素含量低的新品系，其外套膜、闭壳肌均为白色。SRB-like-3基因是已验证的与类胡萝卜素富集相关的关键基因，其只在“南澳金贝”中表达。本研究首先构建了含SRB-like-3基因的重组质粒，将此质粒以电穿孔-精子介导的转基因（SMGT）方法导入褐色品系扇贝精子中，研究分析电穿孔对其精子生理特性的影响及转染效果，探讨华贵栉孔扇贝电穿孔-精子介导的转基因技术的可行性。主要研究结果如下：1）最佳电脉冲参数的确定：经过三个不同水平筛选，初步确定了几组脉冲电压与脉冲时间的参数组

5、合，分别为50V，4ms、100V，1ms、150V，800μs、200V，700μs、250V，400μs、300V，200μs、350V，200μs、400V，200μs、450V，100μs、500V，100μs。并从中选取100V、200V、250V、300V、400V、500V对应的脉冲组合作为后续实验的条件。在这六组脉冲参数组合下分别检测了精子成活率、活动率、受精率和孵化率。结果显示，脉冲参数为500V，100μs时，精子成活率和快旋精子率与对照组均有极显著性差异（P＜0.01），精子在各电击条件下的总活动率与对照组均有显著性差异（P＜0

6、.05）。电击后的精子与卵子受精，受精率均达到80%以上，孵化率均在90%以上。PCR结果显示，DNaseⅠ处理前后，电击组与孵育组均检测到阳性条带。2）外源DNA浓度对电穿孔效果的影响：无论是环状质粒还是线性质粒，在一定范围内，质粒浓度越大，基因导入效果越好。本实验中，质粒浓度为15μg/ml的导入效果最佳。3）外源DNA及孵育对精子的影响：外源DNA的存在并不会对精子的活动率、受精率、孵化率产生影响；孵育会降低精子活动率，但受精率、孵化率则不受影响。4）外源DNA在担轮幼虫和D-型幼虫中的导入及表达效率：PCR结果显示，在担轮幼虫中能检测到线性质

7、粒组的外源DNA的信号，在D-型幼虫中能检测到环状质粒组的外源DNA的信号。qPCR结果显示，环状质粒组和线性质粒组的SRB-like-3及EGFP基因在担轮幼虫和D-型幼虫中均有显著性表达，且担轮幼虫I汕头大学硕士学位论文中，线性质粒组SRB-like-3及EGFP基因的表达显著高于环状质粒组。以上研究结果表明，电穿孔华贵栉孔扇贝精子的最佳电击条件为400V，200μs。质粒通过直接孵育或电穿孔的方法均能进入华贵栉孔扇贝精子，电穿孔确实能辅助精子吸收外源基因，提高转基因的效率。线性质粒的导入效果比环状质粒好。外源DNA通过电穿孔精子的方法能成功导入

8、华贵栉孔扇贝胚胎中并表达。电穿孔精子介导的转基因方法在华贵栉扇贝中是可行的。关键词：华贵栉孔扇贝（Chlam