栉孔扇贝BAC文库的构建及质量评价.pdf

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1、第43卷第11期2013年11月中国海洋大学学报PERl0DICAI。OF0CEANUNIVERSITYOFCHINA43(11)：057～063NOV．，2013栉孑L扇贝BAC文库的构建及质量评价。赵柏淞，程洁，陈亮，于娜，黄晓婷”，包振民(中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛266003)摘要：本研究构建了栉孔扇贝3个BAC文库，分别为BamHI文库，HindⅢ文库和Sau3AI，其中BamHI文库包含34560个克隆，平均插入片段为98kb，未发现空载；HindIll文库包含1

2、32480个克隆，平均插入片段为106kb，空载率为1．67％；Sau3AI文库包含23040个克隆，平均插入片段为53kb，空载率为3．33％。3个文库总共由190080个克隆组成，平均插入片段为98kb，覆盖栉孔扇贝基因组的15．4倍。通过对随机挑选BAC克隆100代的继代培养，未发现插入片段的丢失或重排现象，说明所构建的BAC文库是稳定的。将所有克隆进行超级池及二级池的构建，筛选了3个基因及遗传图谱上的7个微卫星标记，阳性克隆数在6～18之间，表明这3个文库可以在目的基因或标记的筛选、物理图谱的构建及

3、大规模基因组的测序中发挥重要作用。关键词：栉孑L扇贝；BAc文库；基因组中图法分类号：S197文献标志码：A文章编号：1672—5174(2013)11—057—07栉孔扇贝(Chlamys．向rreri)是我国北方重要的海水养殖贝类，近年来随着养殖规模的不断扩大，养殖区病害频发，种质衰退，养殖环境恶化等因素严重制约了栉孔扇贝养殖业的健康持续发展[113]。开展栉孔扇贝基因组研究，对于了解重要经济性状的遗传，开发重要经济性状的遗传调控基因，指导品种改良和遗传育种具有重要意义。在栉孑L扇贝基因组研究过程中，大

4、片段基因组文库扮演着很重要的角色。张玲玲等构建了第一个栉孔扇贝的Fosmid基因组文库[4弓]，文库包含133851个克隆，插入片断平均长度较小，覆盖栉孑L扇贝基因组的4．3倍；随机挑选Fosmid文库中2016个克隆进行双末端测序，获得了部分基因组序列，对栉孑L扇贝基因组结构进行了初步分析；利用FISH技术将12个克隆定位到染色体上，实现了栉孔扇贝8对染色体的区分鉴定。张洋等构建了栉孑L扇贝的BAC文库[6]，由BamHI和MboI文库组成，文库共包含81408个克隆，平均插入片段约为113kb，覆盖率约

5、为栉孑L扇贝单倍体基因组大小的9．1倍。张晓军等利用这个BAC文库构建了第一个栉孔扇贝限制性酶切图谱[7]，并与栉孔扇贝的微卫星遗传图谱进行初步整合。虽然栉孔扇贝的2个大片段基因组文库已经建成，但是，由于Fosmid文库插入片段为40kb，覆盖率偏低，BAC文库酶切位点过于单一，且文库构建过程时采用了混合个体，以上问题都会影响到栉孔扇贝物理图谱的构建及大规模测序和序列拼接等工作。因此本研究采用3种不同的限制性内切酶，选择单一栉孑L扇贝个体的基因组DNA，以pCClBAC为载体构建3个不同的大片段基因组文库，

6、并对文库进行质量评价，为其遗传图谱与物理图谱的整合以及全基因组框架图构建奠定基础。1材料与方法1．1材料实验选用的栉孔扇贝采自辽宁大连獐子岛附近深水域，活体解剖剥离闭壳肌、鳃丝、性腺、外套膜及内脏团，经液氮冷冻后，存放于--80oc超低温冰箱保存。1．2方法结合Peterson[8]和ZhangE9]的BAC文库构建技术，构建栉孑L扇贝个体BAC文库。1．2．1BAC载体的获取本实验所需载体来自美国EPICENTRE公司的CopyControlTMBACCloningKit文库构建试剂盒。1．2．2栉孔扇贝

7、高分子量DNA制备取栉孑L扇贝材料液氮研磨后，分离出细胞核，用1％的低熔点琼脂糖进行包埋制成琼脂糖块。琼脂糖块经蛋白酶K消化48h，再用PMSF(苯甲基磺酰氟)处理琼脂糖块，然后存放于4℃的TE备用。1．2．3基因组DNA部分酶切为确定获得合适的酶切条件，对于3种酶分别进行酶切反应的条件优化。以BamHI为例，取3个琼脂糖块，每个琼脂糖块切成*基金项目：国家自然科学基金项目(31270047)；国家高技术研究发展计划项目(2012AAl0A410，2012AA092204)；国家科技支撑计划项目(2011B

8、ADl3801)；现代农业产业技术体系建设专项资助收稿日期：2012一lO一31；修订日期：2013—03—12作者简介：赵柏淞(1985一)，男，博士。E—mail：jobson007@163．corn**通讯作者：E—mail：xthuang@OUC．edu．cn中国海洋大学学报均匀的8小块微琼脂糖块，将每4个微琼脂糖块转移到1．5mL离心管中，加入预冷的Incubationbuffer，冰浴120rain，