hhv8orf57启动子中应答元件在rta激活和irf7抑制基因表达中的作

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1、l[1111IIrIIrTIIIIIIIIlY1849310南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：割瞳龌2010年5月20日非公开学位论文标注说明根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学

2、位论文，公开学位论文本说明为空白。论文题目申请密级口限制(≤2年)口秘密(≤10年)口机密(≤20年)保密期限20年月日至20年月日审批表编号批准日期20年月日限制★2年(最长2年，可少于2年)秘密★10年(最长5年，可少于5年)机密★20年(最长lO年，可少于10年)摘要摘要人类8型疱疹病毒(humanherpesvirus8，HHV-8)也称卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV)，是艾滋病患者最常见并发症一卡波希肉瘤的致病原。与其它疱疹病毒类似，HHV-8感染也会经历潜伏和裂解周期，潜伏向

3、裂解复制的转换由HHV-8开放阅读框(openread啦frame，ORF)50基因编码的复制与转录激活蛋白(replicationandtranscriptionactivator,RTA)来控制。RTA可以通过与靶基因启动子上的RTA应答原件(RTAresponseelement,I眦)直接结合而激活下游病毒基因的转录，这些下游基因包括PAN、K2、K9、K14、OI疆37、ORF52、ORF56和ORF57基因等。病毒的ORF57基因编码一个称为mRNA转录物积累蛋白的病毒早期核蛋白，是控制病毒复制从早期到晚期转换的关键。OI疆57启动子中的40bp区段(n

4、t81904-81943)介导RTA的转录激活。在此区段中已发现两个富含AT的RTA应答元件，分别称为RREl和RRE2，其中RREl与病毒K8启动子序列同源，而RRE2不仅结合RTA，还能结合宿主编码的干扰素调节因子7(interferonregulatoryfactor7，IRF．7)。RTA和IRF-7对RRE2的竞争影响RTA对ORF57启动子的转录激活，并调控病毒的活化。在RREl和RRE2之间有一个7bp的重组信号序列结合蛋白JK(recombinationsignal-bindingproteinkRBP-JK)识别位点，可能参与RTA与RRE的结合

5、。为研究HHV-8ORF57启动子40bp区段中的各元件对RTA和IRF．7的应答，以及寻找该区段外新的IU冱，本文利用上游引物l一5和下游引物6或7扩增ORF57启动子片段，分别插入到pGL3．basic载体来构建系列缺失型报告质粒S1-$5和L1．L5，它们分别包含ORF57启动子中从nt81556，81904，81918，81930或81944到转录起始位点1(m82003)或转录起始位点2(nt82081)之间的序列。此外还对元件进行不同组合构建出报告质粒CI-C8，以检测应答元件的数目和距离对RTA激活和IRF．7抑制的影响。以S1-s5报告质粒单独转染

6、或与RTA和IRF．7表达质粒共转染293T细胞，测定萤火虫荧光素酶活性，发现RREl对于RTA的转录激活非常关键，缺失RREl的报告质粒对RTA几乎没有应答。用同样方法检测Ll-L5报告质粒，发现缺失RREl的报告质粒仍保留对RTA和IRF．7的应答，直至进一步缺失掉RBP-JK位点才彻底丧失对RTA和IRF．7的应答能力。比较S系列与L系列报告质粒的转染结果发现，在两个转录起始位点之间，即nt82003和82081之间的78bp区段中可能存在一个新的功能性RRE，它能介导RTA的转录激活，还能弥补由于缺摘要失RREl造成的对RTA应答的缺失。我们将这个新鉴定的

7、功能性RRE命名为RRE4，对其精确位置和作用机制还有待于进一步深入的研究。共转染IRF．7表达质粒发现，IRF．7除了能有效抑制RREl介导的RTA激活外，还能抑制RRE4介导的RTA激活，暗示IRF．7对临近RRE的抑制不表现出方向性。Cl-c8报告质粒的转染结果显示，增加I吡1的数目对RTA的激活作用无显著影响，但是增加RBP．JK位点的数目不仅使RTA的激活得到增强，且RTA的激活作用不能被IRF．7所抑制。反之，缺失RBP．k位点的报告质粒对RTA几乎没有应答，暗示RBP．JK位点在介导RTA激活ORF57启动子方面的关键作用。通过改变应答元件之间的距离

8、发现，轻微