rnai抑制内源性基因表达在肝脏疾病研究中的应用论文

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1、RNAi抑制内源性基因表达在肝脏疾病研究中的应用论文.freelRNA的同源区进行特异性结合，因RISC具有核酸酶的功能，在结合部位可以切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。另外，siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsR-NA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将

2、靶mRNA完全降解［2］。RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征:①RNAi是转录后水平的基因沉默机制;②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的mR-NA［3，4］;③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达;④dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而使细胞非特异性和全面的基因表达

3、受抑和凋亡;⑤ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程［5］。RNA干扰技术的关键是要根据内源或外源靶序列来设计合成由21nt～23nt组成的siRNA或者siRNA表达载体，并以某种方式将其导入靶细胞中，从而诱发靶序列的特异性降解，阻止靶序列继续表达和翻译。人体的许多疾病是由外源基因入侵或内源基因突变和异常表达所引起的。针对以病毒感染为主的外源基因入侵的RNAi研究已经广泛开展并取得了一定成果。如抗HIV［6～8］、抗HCV［9，10］、抗脊髓灰质炎病毒［11］和鼠疱疹病毒［12］、抗HBV［13］等，而针对由

4、于内源基因突变或异常表达所引发的疾病，RNAi同样发挥重要作用。现就RNAi抑制某些内源性基因过度表达或肿瘤基因表达在肝脏疾病中的应用研究进展情况报告如下。2RNAi对内源性基因的抑制作用2.1RNAi抑制体内TNF-α过度表达TNF-α是一具有多种生物学活性的多肽调节因子，来源于单核巨噬细胞。适量的TNF-α可以调节机体免疫功能，对维持机体内部的稳定状态及抵御各种致病因子具有重要意义。然而，TNF-α的异常分泌又可作为机体炎症、损伤及休克的重要介质［14］。近年来，肠源性内毒素血症（intestinalendotox-emia，IETM）与肝病的关系日益受到重视，

5、急、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化与肝癌患者的IETM发生率报道不一，其中以重型肝炎患者IETM的发生率（80%～100%）为最高、程度最为严重。内毒素可通过两个途径激活肝脏枯否细胞，一是膜连接形式（mCD14），mCD14是经典的CD14依赖途径，由脂多糖结合蛋白（LBP）将LPS运送至枯否细胞膜上与相应受体CD14结合，激活细胞内信号转导系统，最终导致NF-κB的活化，促进TNF-αmRNA及其它细胞因子转录产物的形成，释放大量促炎细胞因子，扩大了炎症反应［15］。其中TNFα是最为关键的促炎细胞因子。TNFα吸引中性粒细胞进人肝脏，并促使其产生呼吸爆发，释放氧自由

6、基，导致脂质过氧化反应，加重肝坏死。TNF-a能诱导肝窦内皮细胞和肝细胞大量表达ICAM-1，并可促进细胞毒性T淋巴细胞攻击肝细胞，导致肝细胞大量坏死。TNFα免疫组化定位研究表明，TNFα还参与了内毒素介导的肝纤维化过程。可见，TNF-α的过度表达与肝病严重程度及暴发性肝衰竭的发病机制密切相关。因此，以TNF-αmRNA为靶点，采用RNAi技术特异性抑制TNF-αmRNA的表达，减少TNF-α的分泌，对降低肝细胞损伤，保护肝细胞功能具有重要意义。SorensenDR等用阳离子脂质体SiRNA抑制TNFa基因的表达，成功地达到在小鼠体内抗内毒素诱导的肝脏损伤，败血症

7、小鼠的存活率明显增加［16］。2.2RNAi抑制Fas过度表达Fas是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的细胞表面分子，其配体FasL同Fas结合后可以导致携带Fas受体的细胞凋亡。Fas和FasL结合被阻断或因基因突变而丧失功能，可以发生淋巴细胞增殖性疾病及自身免疫加剧，肝细胞的过度凋亡同样可以引发肝功能衰竭。经研究发现，正常人肝细胞不表达Fas抗原，病毒感染肝细胞后可使受损肝细胞表达Fas抗原，且表达程度与肝脏损伤的严重程度一致。表达FasL的CTL等细胞同Fas结合引发病毒感染肝细胞的凋亡，达到清除病毒的目的。在乙型肝炎病毒引起的重症肝炎发病时可出现细胞凋亡