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《uv-c 照射诱导体外血管平滑肌细胞凋亡模型的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、234 生理学报,1999年4月,51(2),234～239ActaPhysiologicaSinica实验技术UV2C照射诱导体外血管平滑肌细胞凋亡模型的建立李晓丹 李 进3(广州军区医学高等专科学校内科教研室,广州510315)摘 要 应用常规细胞培养超净台紫外消毒灯(220W,220V,50Hz)发射的UV2C波段的紫外光源(254nm),垂直照射距离其10cm处的大鼠主动脉平滑肌细胞(smoothmusclecells,SM2Cs),发现经照射后细胞出现典型的凋亡形态学改变,如细胞变圆、染色质浓缩、细胞膜出泡、出现凋亡小体等;细胞面积、核面积及核/胞面积比
2、均显著降低;且提取细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳呈现梯状图谱。从形态学和生化指标方面证明了UV2C照射可诱导体外血管SMCs凋亡。此方法可作为进一步研究SMCs凋亡的内在调控机制的一个简便、稳定、可靠的模型。关键词:平滑肌细胞;细胞凋亡;紫外线;动脉粥样硬化学科分类号:Q2233 动脉中膜平滑肌细胞(smoothmusclecells,SMCs)向内膜迁移并大量增生被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的核心病理过程。近年来发现,SMCs的凋亡也参与了AS的发生和发展,无论在正常血管调节数量平衡,还是在早期血管损伤方面及在血栓性病变的发生过程中,
3、SMCs的凋亡均起了重要作用。但目前对SMCs凋亡的研究尚属起步。本文
应用紫外线2C(ultravioletC,UV2C)波段照射诱导体外SMCs凋亡,在形态学和生化指标方面进行凋亡的检测,以期为今后进一步从细胞、亚细胞和分子水平深入研究SMCs凋亡的内在调控机制提供一个简便、稳定、可靠的模型。现将本方法简要介绍如下。 体外血管SMCs培养及鉴定[1] 选定重约150～200g的成年SD大鼠,无菌条件下取出胸主动脉,剥离中膜,参照传统的组织贴块法进行SMCs原代及传代培养,应用SP免
疫组织化学方法检测细胞内α2平滑肌肌动蛋白(α2smoothmuscleac
4、tin,α2SMactin)的表达。
UV2C诱导体外SMCs凋亡模型的建立 取第4～7代生长良好的SMCs,胰蛋白酶
消化,以105/ml浓度接种于直径60mm的培养皿上。48h后待细胞完全贴壁生长良好时
吸去培养基,清洗2～3次。之后以015mlD2Hank′s液湿润皿底,垂直置于细胞培养超净
台之UV2C紫外光源下10cm处,打开皿盖,照射10min,照射过程中须保持皿底湿润不干 1997210210收稿 1998204201修回 3现在地址:第一军医大学组织胚胎学教研室,广州5105152期 李晓丹等:UV2C照射诱导体外血管平滑肌细胞
5、凋亡模型的建立235燥。照射后加10%DMEM培养基,置5%CO2孵箱中继续培养,动态观察细胞形态变化。 UV2C诱导体外SMCs凋亡的形态观察 将4～7代常规传代的大鼠SMCs接种在置于培养皿内的盖片上生长。48h后待细胞贴壁良好后,依上述方法应用UV2C照射。然后加入培养基继续培养,动态观察细胞形态变化。并于照射后24、48h取出盖片,行HE染色,光镜下观察。UV2C诱导体外SMCs凋亡的形态计量学研究 接种细胞于盖片上,依上法应用UV2C照射。取照射后24、48h及未照射的相应对照组细胞切片各4张,用D2Hank′s液冲洗2～3次,自然干燥,再用纯丙酮固
6、定10min。每张切片测定5个视野,每个视野测定10个细胞,4张盖片共20个视野、200个细胞。以每个视野为单位(n值),用Quantimet520+图像分析仪进行场测量,选择细胞面积(cellulararea,CA)、核面积(nucleararea,NA)及其两者的比值(ratioofarea,RA)为定量参数。此3项参数关系如下式:RA=NACA×100%. 统计学处理 各组定量检测所得结果以均数±标准差(x±s)表示,进行两样本均数比较的t检验,用SPLM软件(第四军医大学卫生统计学教研室研制)在微机上进行处理。实验分组 正常对照组(Control);照
7、射组(UV2C).生化指标检测 细胞DNA提取及凝胶电泳:依上述方法,应用UV2C照射体外培养的SMCs,分别于照射后24、48h离心收集细胞,1000r/min离心5min,去上清液,用4mlPBS重悬细胞,置于50℃水浴箱内。超过3h,至看不见絮状物时,加平衡酚500μl抽提,上下颠倒数次,充分混匀,6000r/min离心5min,取上清液,加氯仿2异戊醇(24∶1)500μl抽提,上下颠倒数次,充分混匀,6000r/min离心5min,取上清液,加入3mol/L乙酸钠50μl及无水乙醇1ml混匀,-20℃过夜,1000r/min离心10min收集沉淀,弃
