血管平滑肌细胞体外培养与诱导钙化研究

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1、精选公文范文管理资料血管平滑肌细胞体外培养与诱导钙化研究血管平滑肌细胞（vascularsmooth[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料血管平滑肌细胞体外培养与诱导钙化研究血管平滑肌细胞（vascularsmooth[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料musclecells,VSMCs）是动脉发生钙化的主要细胞，最近研究发现血管钙化类似于骨的形成，它是由细胞介导的主动调节过程，同时存在平滑肌细胞表型转变，并与多个成骨相关类因子相关[1].以往体外研究动脉病变的平滑肌细胞主要来自

2、动物或人的主动脉[2],而对外周动脉的研究很少。血管平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成份，它的钙化与血管的许多生物学行为有关。既往报道[3],VSMCs体外培养后传代，其生物学特性仍然接近体内细胞，以体外培养VSMCs为基础。模拟各种体内外干预条件，观察研究VSMCs的细胞及分子生物学特性的改变，是研究心血管疾病发病机制的良好手段。本研究以酶消化法为基础，总结一种方便、快捷、重复性高的分离、培养方法并进一步建立体外平滑肌细胞钙化诱导模型，为外周动脉病变体外研究奠定基础。　　　　1材料与方法　　　　1.1材料　　　　DM

3、EM培养基（Hyclone公司）、胎牛血清（Hyclone公司）、DAPI染液（Sigma公[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料司）、DMSO,0.25%胰蛋白酶（上海碧云天公司）、一抗：α-SMA单克隆抗体（Bioworld公司）、二抗：羊抗兔FITC标记二抗（武汉博士德公司）、山羊封闭血清（北京博奥森公司）。　　　　1.2人股动脉VSMCs的体外培养　　　　1.2.1人股动脉分离及原代培养　　　　取正常人股动脉，由中山大学附属医院血管外科王冕博士提供，取自于正常遗体捐献者。无菌环境下手术刀片刮

4、除外膜和内膜，将中膜平滑肌层分别剪成1~2mm大小的组织块，镊子逐个贴在25cm2培养瓶上，培养瓶缓慢翻转，加入20%的胎牛血清含100U/L的青链霉素的DMEM培养液10ml,孵育在37℃，5%的CO2的培养箱中；2h后轻轻翻转培养瓶，组织块被充分覆盖。培养箱中孵育，2周左右观察平滑肌细胞生长情况。　　　　1.2.2人股动脉平滑肌细胞的传代培养　　　　将相互融合的原代培养的人股动脉VSMCs,在换液后的d3,弃去原培养液，用无菌的PBS轻轻冲洗3遍，用胰酶消化1min后，随即加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养液

5、终止消化，用吸管反复吹打培养瓶100次，注意用力不能太大，否则细胞破碎。使细胞完全脱离瓶壁，镜下计数：调整密度为1.0×105/[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料ml的细胞悬液，吸取5ml传入新的培养瓶中，每3d换液1次，每次换液量约4ml,待细胞长至融合状态后，可再传代。　　　　1.3人股动脉平滑肌细胞的鉴定　　　　1.3.1细胞形态学观察　　　　将培养的平滑肌细胞置于倒置显微镜下，观察细胞贴壁、生长状况及形态并照相。　　　　1.3.2免疫荧光染色　　　　（1）将平滑肌细胞接种在13mm直径圆

6、形载长约40%~50%左右，吸取培养基，加PBS冲洗3次，每次5min左右；（2）加入4%的多聚甲醛4℃条件下固定15min,加入PBS冲洗5min×3次，之后用预冷CH3OH洗3次；（3）预冷CH3OH-20℃通透平滑肌细胞5min,PBS再次冲洗5min×3次；（4）用10%的山羊血清5%BSA封闭液室温封闭20min,加入1:150小鼠抗人平滑肌α-actin单克隆一抗，4℃[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料孵育过夜，次日室温复温1h;（5）加入PBS清洗5min×3次，滴加绿色荧光标记的

7、羊抗小鼠二抗，室温避光孵育1h,PBS清洗5min×3次；（6）DAPI染液染细胞核15min,ddH2O清洗；（7）MountingMedium封片，荧光显微镜拍照，4℃避光保存。　　　　1.4冻存细胞　　　　选融合度>90%的细胞；按传代方法用EDTA把贴壁生长的细胞消化下来，反复吹打100次；1000rpm离心去上清，吸入离心管中。先用DMEM高糖培养基8份+1份胎牛血清+1份二甲基亚砜配成10%的细胞冻存液，混匀后吸管吸至10ml离心管中，然后吹打细胞，动作轻柔，使细胞充分混匀。分装至1.5ml冻存管中。将细

8、胞冻存管放入4℃冰箱30min,后置入-20℃冰箱2h后，直接放入-80℃[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料冰柜中。　　　　1.5钙化模型的建立　　　　用钙化培养基（正常对照组的DMEM培养基中加入10mmol/Lβ磷酸甘油，10mmol/L丙酮酸）培养，2d换液1次，连续培养10d,以制备钙化的VSMCs.　　　　1.6