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1、体外培养血管平滑肌细胞的同步方法：江明宏,舒茂琴,王倩,覃跃龙,李建涛,曹雪滨【摘要】 目的:探讨体外血管平滑肌细胞（VSMC）同步化的培养及意义。方法:采用组织块贴片法原代培养大鼠胸主动脉VSMC,利用双胸苷阻断和秋水仙素阻抑法使VSMC达到细胞周期同步化。结果:经鉴定培养的细胞为VSMC,采用血清饥饿法、双胸苷阻断法和秋水仙素阻抑法分别获得了处于不同细胞周期的同步化的VSMC:G0/G1期(89.22±3.54)%,G1/S交界期(66.74±7.16)%,S期(63.24±4.06)%,G2/M期(
2、51.64±11.18)%。结论:同步了体外培养的VSMC,为研究冠状动脉粥样硬化的发病机制奠定了实验基础。【关键词】血管平滑肌细胞细胞周期同步化 血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells,VSMC）的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成型术术后再狭窄的主要病理表现,引起VSMC增殖或增生的信号转导机制目前尚不完全清楚,但揭示VSMC增生或增殖的信号通路具有重要意义,而增殖信号转导最终的共同通路是细胞周期进展［1］。因此,研究细胞周期与VSMC之间的关系,建立有效的能
3、将VSMC同步各个细胞周期阶段,对于揭示动脉粥样硬化的发病机制具有重要的指导作用。以往一直着力于VSMC增殖方面的研究［2,3］,对于VSMC细胞周期同步化,文献报道采用血清饥饿法同步G0/G1期［4,5］,而对于G1/S期、S期、G2/M期的同步效果尚未见报道,我们通过原代培养的大鼠VSMC,采用胸苷、秋水仙素同步化,寻找同步方法的最佳条件,利用流式细胞术（FCM）测定其同步效果,分析在不同细胞周期中VSMC的DNA含量情况,为冠状动脉粥样硬化的发病机制的研究提供实验基础。 1材料和方法 1.1材料S
4、D雄性大鼠（体质量120～150g,共20只）由第三军医大学实验动物研究所提供。DMEM（高糖型）培养基为Gibco公司产品、胎牛血清购自杭州四季青,胰酶（Amerisom）、小鼠抗大鼠α-SM-actin购自武汉博士德公司,FITC标记抗小鼠IgG购自北京中杉公司,胸苷、秋水仙素、DMSO、MTT试剂均购自Sigma公司。 1.2方法 1.2.1大鼠VSMC原代培养及鉴定(1)大鼠VSMC原代培养:用1g/L戊巴比妥钠1.0mL注入腹腔内,麻醉SD大鼠,无菌条件下分离全段胸主动脉血管,置于含青霉素10
5、0U/mL、链霉素100μg/L的无菌高糖DMEM中,在细胞培养室用眼科镊夹取血管外层组织,DMEM培养基冲洗2遍,眼科剪把血管剪开,用棉签把内皮刮掉DMEM(含4mL/L胎牛血清)清洗2遍,眼科剪把其组织块剪碎成1mm×1mm大小组织块,用眼科剪把组织块送入50cm2培养瓶,用吸管将其均匀分布,将培养瓶翻转,另一面加入3mLDMEM(含200mL/L胎牛血清),3～4h后翻正,使组织块完全浸没于组织块中,静置于37℃、50mL/LCO2培养箱,5～7d可见组织块从周围游出,80%～90%给予传代,4～6代
6、用于实验。每次取材2只SD大鼠,总共20只。(2)大鼠VSMC鉴定:用倒置显微镜观察细胞形态及生长方式。免疫荧光鉴定:细胞爬片取出后0.01mol/LPBS(pH7.2)清洗5min×3次;用950mL/L无水乙醇室温下固定20min,同上清洗;100mL/L正常山羊血清封闭液,湿盒内温育30min,PBS清洗;加1∶100（小鼠抗大鼠α-SM-actin）,置湿盒内4℃反应过夜,同上清洗;最后用1∶100(FITC-抗小鼠IgG),湿盒内37℃孵育1h,同上清洗;在荧光显微镜下观察拍照并保存。 1.2.
7、2大鼠血管平滑肌细胞细胞生长曲线的变化以103～104/孔接种细胞于96孔培养板中,按不同分组分别加200μL含100mL/L,血清浓度的培养液,于培养后第1天至第7天。绘制细胞生长曲线各组分别取3孔进行检测。每孔加入5g/LMTT溶液20μL,置于恒温细胞培养箱继续培养4h,弃培养液,加入DMSO150μL,振荡10min,使结晶物充分溶解,用酶标仪检测A490值。以天数为横轴,吸光度为纵轴绘制细胞生长曲线。 1.2.3细胞同步化用双胸苷同步法使细胞同步化于G1/S期和S期［6］:选取生长良好的细胞,当
8、其融合率达50%～60%,首先加入胸苷使培养液的终浓度为2mmol/L;16h后去除含胸苷的培养液,并用0.01mol/L,洗2次,并加入新鲜的培养液培养18h;再次加入胸苷使其终浓度为2mmol/L,继续培养14h;0.01mol/LPBS液洗2次后,此时细胞大多数处于G1/S交界期（2mmol/L胸苷的培养基可使dTTP上升5倍,DNA复制受阻）。用0.01mol/LPBS冲洗2遍,采用新鲜的培养液培养（含1
