有关体外培养人牙周膜细胞方法的探讨

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1、有关体外培养人牙周膜细胞方法的探讨细胞体外分离培养是研究复杂的生物系统的重要手段，细胞培养条件下，将细胞从复杂的体内环境转移到较为简单的体外环境，可对细胞学研究中的变量进行分离和控制。上世纪70年代以来，国外学者对牙周膜细胞（PeriodontalLigamentCellsPDL）分离纯化进行了大量的探索和研究，且成功地从猴、猪、人等牙周膜分离培养出牙周膜细胞［1～3］。人牙周膜细胞（hPDL）分离培养主要有酶消化法和组织贴块法［4］。国内外学者对这2种方法评价不一，并且在这2种方法的基础上进行改

2、进提出了酶消化组织块法和全牙消化法［5］。对组织块法、酶消化组织块法和全牙消化法这3种方法做了一些比较，以寻求hPDL体外培养的最佳方法。　　1材料和方法　　1.1试剂及主要实验仪器设备　　α-MEM培养液（Hyclone，USA），胶原酶（TypeI，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25%,过滤分装，冷冻保存），青霉素100U/ml，链霉素100mg/L；SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德），角蛋白抗体及波丝蛋白抗体（武汉博士德），二氧化碳恒温培养

3、箱，倒置相差显微镜，血球计数板。　　1.2方法　　1.2.1组织块法培养hPDL　　（1）取材：选择健康青少年（12～18岁）正畸拔除的健康的双尖牙，超净工作台内用刀片仔细刮除附着牙龈及根尖组织，用D-Hanks液冲洗3次；（2）无菌处理：将牙冠浸入5.25%次氯酸钠溶液中2min，再用含高浓度双抗的D-Haks液冲洗2遍。按照司徒镇强［6］传统组织块培养法进行原代培养；（3）传代：细胞汇合至培养瓶80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化传代。　　1.2.2酶消化组织块法培养hPDL　　酶

4、消化组织块法原代培养在取材、无菌处理上与组织块法相同。刮下根中2/3的牙周膜后，不剪，移入离心管内。0.1%胶原酶37℃消化30min，其中，每5min振荡1次，当肉眼观察到培养液略混浊，显微镜下见组织块松散时，离心，弃上清液，用含血清及双抗的培养基漂洗1次后弃上清液，收集组织块，将组织块平铺于培养瓶底，翻转培养瓶，向内加入4ml培养液，置CO2培养箱孵育2h，使组织块贴壁，再翻转培养瓶培养；传代与组织块法相同。　　1.2.3全牙消化法培养hPDL　　全牙消化法原代培养牙周膜细胞取材、无菌处理与组

5、织块法相同。将牙齿放入装有0.1%胶原酶的青霉素小瓶内，牙根向下，使消化液浸没牙根，37℃温箱内消化1h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培养基，离心，弃上清液，加入3ml培养基（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100mg/L）吹打形成细胞悬液，移入25ml培养瓶内，置CO2培养箱内进行培养，3d换液1次，待细胞铺至瓶底80%时用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。　　1.3细胞的生长情况观察　　1.3.1倒置相差显微镜连续观察细胞原代和传代生长情况。　　　　1.3.2HE染色

6、　　取生长状态良好的第5代细胞进行爬片，用苏木精-伊红染色，观察细胞形态。　　1.3.3细胞免疫化学染色　　将培养的第3代hPDL接种于置有盖玻片的培养瓶中，按常规SABC法操作，进行波丝蛋白抗体、角蛋白抗体染色，光镜下观察染色情况。　　1.3.4描绘细胞生长曲线　　取3块24孔板，分别取3种方法培养的第5代细胞，调整细胞浓度为1104个/ml接种于24孔板，每孔100μl，CO2培养箱内培养4h后每孔加0.5ml培养液继续培养，每天每组各取3孔的细胞作细胞计数，连续观察8d，绘制细胞生长曲

7、线。　　2结果　　2.1形态学观察3种方法培养的hPDL形态学上无太大区别，均呈长梭形或星形，胞突细长，胞体丰满，胞浆均匀，中央有圆形或椭圆型的胞核，细胞呈放射状、漩涡状排列（见图1～3）。HE染色胞核嗜碱性，胞浆嗜伊红（见图4）。　　2.2免疫组织化学鉴定结果免疫组织化学实验显示细胞波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证明为中胚层组织来源（见图5、图6）。　　2.33种方法培养的hPDL生长情况　　2.3.1组织块法　　牙周膜组织块经静置贴壁后，一般8～16d组织块边缘有细胞开始游出，以组织块为

8、中心成放射状、漩涡状生长，生长的细胞以1∶2传代培养，最初5代的细胞3～5d即可长满培养瓶底，生长状态较活跃，核分裂相多见；6～12代细胞，7～10d汇合，细胞增殖稳定。本实验用组织块法培养牙周膜细胞培养了20例，成功1例，成功率5%。　　2.3.2酶消化组织块法　　用此方法所培养的20例中，有4例在5～10d内观察到细胞游出，2例传代成功。细胞以组织块为中心呈放射状排列生长。传代后的细胞生长旺盛，状态良好，原代培养成功率为10%。图1组织块周围长出的牙周膜　　2.3.3全牙消化法