IL-17对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响及机制初探

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1、分类号：R783.5单位代码：10159密级：公开学号：201521169硕士学位论文（口腔临床医学硕士学术学位）中文题目：IL-17对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响及机制初探英文题目：TheEffectandMechanismofIL-17ontheProliferationofHumanPeriodontalLigamentFibroblastsinVitro论文作者：张国容指导教师：张扬教授学科专业：口腔临床医学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文IL-17对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响及机制初探TheEffectandMechanismofIL

2、-17ontheProliferationofHumanPeriodontalLigamentFibroblastsinVitro论文作者张国容指导教师张扬教授申请学位医学硕士培养单位口腔医学院一级学科口腔医学二级学科口腔临床医学研究方向口腔正畸学论文起止时间2015年12月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学位论文摘要目的：牙周炎是我国的一种多发性疾病，也是世界范围内亟待解决的一项公共卫生问题。IL-17是一种主要由Th17细胞产生的促炎因子，在牙周炎患者的血清、唾液和龈沟液中显著升高。人牙周膜成纤维细胞（humanp

3、eriodontalligmentfibroblasts,hPDLFs）是牙周膜中最常见的一种细胞，牙周组织再生修复依赖于它们正常的增殖和分化。有研究证实Notch信号通路参与多种细胞的增殖和分化等过程中。目前，有关IL-17对于hPDLFs细胞增殖影响的研究较少，其机制研究更是鲜有报道。因此，本研究拟探索IL-17对hPDLFs细胞增殖的影响以及Notch信号通路在IL-17影响hPDLFs增殖过程中的作用机制。材料与方法：第一部分，IL-17对hPDLFs增殖和细胞周期的影响：收集患者因正畸因治疗需要而拔除的前磨牙或智齿，取牙根根中1/3处的牙周膜组织，采用酶消化法结合组织

4、块法进行原代细胞培养，并采用免疫组化染色对其进行鉴定；将实验分为4组：对照组、10ng/mlIL-17组、50ng/mlIL-17组和100ng/mlIL-17组，分别在培养第1、3、5和7天后，利用CCK-8试验检测IL-17对hPDLFs增殖活性的影响；采用免疫荧光、结晶紫和碱性磷酸酶染色分别观察IL-17对hPDLFs的细胞骨架、克隆形成率和碱性磷酸酶活性的影响；流式细胞术检测IL-17对hPDLFs细胞周期的影响。第二部分，Notch信号通路参与调控IL-17影响hPDLFs的增殖过程：首先，利用Notch信号通路抑制剂（DAPT）处理hPDLFs，westernblo

5、t检测Notch信号通路中NICD与其下游Hes1蛋白表达情况，CCK-8检测hPDLFs的增殖能力；其次，实时定量PCR和westernblot检测IL-17对细胞周期相关蛋白cyclinD1和p21基因和蛋白表达的影响，westernblot检测IL-17对NICD与Hes1蛋白表达的影响；最后，将实验分为3组：对照组、IL-17组和IL-17+Notch信号通路激活剂组，westernblot检测各组cyclinD1和p21蛋白的表达情况，CCK-8检测各组细胞的增殖活性。结果：第一部分，hPDLFs原代细胞为长梭形，在组织块周围呈放射状生长，免疫组化结果显示：抗波形蛋白

6、染色阳性，而抗角蛋白染色阴性，证实其为hPDLFs；CCK-8结果显示：第1天，4组hPDLFs的吸光光度值（OD值）差异无统计学意义（P>0.05）；在第3天、5天和7天，IL-17各组的OD值均显著小于对照组的OD值（P<0.05）；其中，50ng/mlIL-17组的OD值最小，说明50ng/mlIL-17对hPDLFsIII中国医科大学硕士学位论文增殖能力的抑制作用最大，故将后续实验的IL-17的浓度确定为50ng/ml；免疫荧光染色结果显示：IL-17对hPDLFs的细胞骨架无明显影响；对照组和IL-17组的克隆形成率分别为：37.66%±4.04%，27.33%±3.

7、21%，两组间差异有统计学意义（P<0.05）；IL-17组的碱性磷酸酶染色明显较浅，说明IL-17能抑制hPDLFs的成骨能力；流式细胞术结果显示：与对照组相比，IL-17组的G1期细胞所占百分比增加，但无显著差异（P>0.05）；IL-17组的S期细胞显著减少（P<0.05）；IL-17对G2期细胞百分比无明显影响（P>0.05）。第二部分，DAPT使hPDLFs的细胞增殖能力受抑制，也能使Notch信号通路蛋白NICD和Hes1的表达显著降低（P<0.05）；此外，IL-17能使Not