反义htert体外诱导肺癌细胞凋亡的研究

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1、反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡的研究作者：尹为华，马雅，李若馨，孙来保【摘要】目的研究反义hTERT基因体外诱导肺癌细胞凋亡。方法体外通过SuperFect（QIAGEN）转染正、反义hTERT真核表达载体至人肺腺癌细胞株GLC-82，再经过G418及PCR筛选鉴定获得分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞GLC-82-s和GLC-82-as。然后采用MTT法、双层软琼脂克隆形成实验、流式细胞术观察和分析了反义hTERT对肺癌细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡；同时我们还运用实时荧光定量RT-PC

2、R技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERTmRNA的表达情况及端粒酶的活性进行了检测。结果当各组细胞传至第25代后，与GLC-82、GLC-82-s比较，GLC-82-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低，同时伴有凋亡率的显著增加；与空白对照、正义hTERT组相比，反义hTERT能显著地降低GLC-82细胞内源性hTERTmRNA的表达（P<0.01）和下调端粒酶活性。结论反义hTERT体外确实能明显地诱导肺癌细胞的凋亡及抑制瘤细胞的生长增殖能力。【关键词】反义hTERT；肺癌；凋亡；细胞增殖；实时

3、荧光定量RT-PCR【Abstract】ObjectiveTostudythecellapoptosisoflungcancerinducedbyantisensehTERTinvitro.MethodsThesenseandantisensehTERTeukaryoticexpressionvectorsanufacturer’sinstructions，thentheGLC-82-sandGLC-82-asofG418-resistantcoloniesers.Afterthat，MTTcellularprolifera

4、tionassay，softagarcolonyformationassayandfloetryorcellscanbeinducedtoapoptosisbyantisensehTERT.MeanRNAexpressionandtelomeraseactivitybyquantitativereal-timeRT-PCRandTRAP-silverstainingassayineachgroupcells.ResultsAfter25passagesofthreegroupcells，a7-daycellgrobers(s

5、ize)ofsoftagarcolonyformationshoetry，paredarkablyreducetheendogenoushTERTmRNAexpression(P<0.01)anddoeraseactivityinGLC-82，paredeRT-PCR端粒酶是一种RNA依赖的DNA多聚酶，其主要功能是补充合成端粒DNA；目前已证实端粒酶至少由两种主要成分构成：一种为从头合成端粒DNA提供模板的人端粒酶RNA（hTR）组份，另一为人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位（hTERT），后者才是其活性表达的关键组份和

6、限速因子（rate-limitingfactor）［1］。大量研究表明端粒酶的激活是肿瘤恶性转变的一个早期事件，与肿瘤的恶性程度成正相关［2，3］；同样肺癌及其细胞株也不例外地存在着端粒酶活性的高表达情况［2］，因此封闭和抑制端粒酶使其失活代表着一种恶性肿瘤分子生物治疗的一种新的发展思路，且具有广谱、高效、低毒的应用前景。本研究旨在将靶向端粒酶蛋白亚基的反义hTERT基因真核表达载体转染肺癌细胞GLC-82，观察其对肺癌细胞体外诱导凋亡及增殖生长的抑制作用，为探索恶性肿瘤治疗新途径奠定实验基础和理论依据。1材料与方法1.1材

7、料大肠杆菌DH5α及HeLa宫颈癌细胞株、人肺腺癌细胞株GLC-82为本室冻存，pGEM○R-T载体为Promega公司产品，高效真核表达质粒pcDNA3.1(±)为Invitrogen公司产品，限制性内切酶BamHI、XhoI为NEB公司产品。DNALigationKit为TaKaRa产品。Advantage-GC2PCRKit为Clontech公司产品。G418购自上海Sangon，MTT为美国Amresco产品。其余的所需分子生物学试剂均为Qiagen公司产品。1.2正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定参见图

8、23组细胞第25代之凋亡百分率2.4反义hTERT对肺癌细胞体外增殖生长的抑制作用分别取GLC-82、GLC-82-s及GLC-82-as3组传至第25代的细胞来绘制7日生长曲线，结果见图3。从图3观察GLC-82-as细胞增殖速度较GLC-82、GLC-82-s细胞明显减低，以后4天尤为