苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究

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1、苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究作者：翁山耕，胡雨云，田雄英，林丽娟，林永堃【摘要】目的研究苦参碱对体外培养的大鼠肝星状细胞系rHSC-99凋亡的影响，并探讨其机制。方法体外培养rHSC-99，随机分成4组：对照组(A组)，苦参碱0.12mg/kg组(B组)，苦参碱0.24mg/kg组(C组)，苦参碱0.48mg/kg组(D组)。苦参碱作用24h后，TUNEL法检测rHSC-99凋亡，半定量RT-PCR方法及免疫细胞化学方法检测rHSC-99中神经生长因子(NGF)，p75及Caspase-3的表达情况。结果不同浓度的苦参碱干预rHSC-9924h后，rHSC-99凋

2、亡率随苦参碱的浓度增大而增高，D组凋亡率最高(P<0.01);NGF，p75，Caspase-3mRNA及其蛋白表达随苦参碱的浓度加大而表达升高，C组表达最高(P<0.01)。结论苦参碱可诱导HSCs凋亡。激活NGF/p75通路、上调Caspase-3蛋白表达可能是苦参碱诱导肝星状细胞凋亡的机制之一。【关键词】苦参碱;星形细胞;肝硬化;细胞凋亡;神经生长因子类;神经组织蛋白质类;基因表达肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)的活化在此过程中起关键作用。近来研究表明，逆转肝纤维化关键在于减少活化型H

3、SC的数量，而凋亡是减少活化型HSC数量的主要途径[1]。已发现苦参碱能诱导大鼠肝星状细胞凋亡[2]。本实验观察苦参碱对体外培养的HSC凋亡的影响，并探讨其可能的机制。　　1材料和方法　　1.1材料大鼠肝星状细胞系rHSC-99系保持体外培养激活的HSC特性[3];苦参碱注射液(斯巴特康，广州明兴制药有限公司，10mg/mL，每支5mL，批号：MD2101-2);RPMI1640培养基﹑胰酶﹑新生牛血清(美国Gibco公司);NGF多抗及免疫细胞组化SABC试剂盒(武汉博士德公司);逆转录试剂盒、Taq酶、DNAmarke(美国MBI公司);总RNA提取试剂Trizol(美

4、国Invitrogin公司);原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司);引物由上海生工生物有限公司合成。　　1.2方法　　1.2.1rHSC-99细胞培养含10%新生牛血清的RPMI1640培养液、37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至80%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4传代。　　1.2.2分组取生长良好的rHSC-99，48孔板(免疫细胞化学法和TUNEL检测)或6孔板(RT-PCR检测)。培养24h后再用无血清的RPMI1640液培养24h，随机分为：对照组(加PBS，A组);苦参碱0.12mg/mL组(B组);苦参碱

5、0.24mg/mL组(C组);苦参碱0.48mg/mL组(D组)。药物作用24h后，分别进行形态学观察及以下各项检测。　　1.2.3TUNEL法检测HSC的凋亡各组均设3个复孔。按TUNEL试剂盒说明书操作。　　1.2.4RT-PCR检测NGF，p75，Caspase-3的mRNA表达0.25%胰酶消化并离心收集细胞。按Trizol法提取总RNA，逆转成cDNA。PCR反应体系25μL：10×buffer2.5μL，2mmol/LdNTP2.5μL，MgCL21.5μL(25mmol/L)，Cdna2μL，Taq酶0.625U，β-actin上下游引物各0.5μL(10pm

6、ol/μL)，p75或NGF或Caspase-3上下游引物(表1)各0.5μL(10pmol/μL)，去离子水补足至25μL。反应条件：95℃预变性5min，进入热循环：95℃变性45s→57℃退火45s→72℃延伸50s，28个循环，最后一个循环后72℃继续延伸10min。取8μL产物加溴酚兰2μL混合后经2%琼脂糖凝胶电泳，图象分析仪扫描得出峰值，半定量分析，以p75/β-actin、NGF/β-actin、Caspase-3/β-actin作为其mRNA表达量。　　1.2.5免疫细胞化学法检测NGF，p75，Caspase-3蛋白表达各组均设3个复孔，按SABC试剂盒

7、说明进行操作。显微镜下观察着棕黄色的为表达阳性细胞(凋亡细胞)，摄片。免疫细胞化学实验结果采用H-score法评分法分析。　　1.3统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS11.5软件系统分析，单因素方差分析检验，Kruskal-：marker.　　A:NGF蛋白表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞;B：p75蛋白表达，细胞核呈着棕黄色染色的为阳性细胞;C：Caspase-3蛋白表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞.　　(2.730±0.988)，(1.980±0.146)。与A组比较，B，C，D组的p75蛋白