脂质体转染大鼠肝星状细胞的实验研究

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1、脂质体转染大鼠肝星状细胞的实验研究霞贵州省人民医院急诊科，贵州贵阳550000[摘要]目的运用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠肝星状细胞（HSC-T6），比较不同质粒与脂质体比例及不同时刻转染HSC后绿色荧光蛋白的表达，确定高表达阳性克隆G418筛选条件。方法将细胞按质粒与脂质体的不同比例分为四组：A组（2ug：3uL），B组（2ug：4uL），C组（2ug：5uL），D组（2ug：6uL）混合后转染大鼠HSC，约24h观察转染率，以最高转染率的质粒与脂质体混合，转染大鼠HSC，比较转染后24、48、72h的转染率；用不同浓度G418进

2、行筛选，确定筛选最佳浓度，通过G418筛选建立高表达EGFP的HSC-T6阳性克隆。结果转染24h后，各组均有绿色荧光蛋白的表达，与A、B、D组比较，C组转染率明显增高（P＜0.05），质粒与脂质体以2ug：5uL转染HSC后，随时间延长，转染后48h转染率最高（P＜0.05），72h有所下降，G418筛选最佳浓度为400ug/mL，经筛选约21d后可阳性克隆，更换为正常培养液可继续培养和传代。结论Lipofectamine2000可有效转染HSC，经G418筛选形成阳性克隆，为基因治疗肝纤维化的研究提供依据。[.jyqkine2000转染HSC-T6

3、的条件及方法。1资料与方法1.1一般资料大鼠肝星状细胞株HSC-T6、pcDNA3.1(+)-EGFP质粒由武汉协和医院胃肠病实验室提供。感受态大肠杆菌DH-5ɑ购自武汉晶赛生物工程技术公司，小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司，G418购自北京索莱宝生物科技有限公司，阳离子脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。1.2方法1.2.1质粒的提取pcDNA3.1(+)-EGFP质粒转化大肠杆菌DH-5ɑ，扩大培养后，采用小量质粒提取试剂盒提取质粒，用紫外分光光度计测定浓度，调整质粒浓度为1ug/ul，过滤灭菌备用。1.2.2细

4、胞培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6在含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，体积分数为5%CO2孵育箱中培养。转染前一天，将HSC-T6细胞接种于6孔培养板，每孔2×105个细胞，过夜培养后，按质粒与脂质体比例分为四组：A组（2ug：3ul），B组（2ug：4uL），C组（2ug：5uL），D组（2ug：6uL）。1.2.3细胞转染取一试管加入pcDNA3.1(+)-EGFP质粒，用250uLOpti-MEM培养基混合稀释，另取试管分别加入3uL，4uL，5uL及6uLLipofectamine2000，用250uLOpti-MEM培养基混

5、合稀释，室温无菌条件下放置5min，将质粒分别与不同剂量Lipofectamine2000混合后放置20min，每孔加入量为500uL混合液培养4h，更换培养液继续培养，4h后记数10个200倍视野下发绿色荧光的细胞及同视野光镜下细胞数计算转染率，确定质粒与脂质体转染的最佳比例，按质粒与脂质体最佳比例转染HSC-T6，观察转染24、48、76h转染率，各组细胞设置三个复孔。1.2.4G418筛选将HSC-T6接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，培养过夜后，分别加入含100、150、200、250、300、350、400、500、700ug/mL，8

6、00ug/lG418培养基，15%FCS的DMEM培养液2ml，观察15d后细胞全部死亡的G418最低浓度，实验均重复三次。1.2.5G418筛选阳性克隆将HSC-T6细胞接种于6孔培养板，每孔2×105个细胞，过夜培养后，按细胞转染方法，将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine2000按最佳比例转染HSC，4h后改用含G418培养基进行筛选，筛选出阳性克隆后，更换为正常培养液继续培养和传代。1.3统计学分析记量资料用均数±标准差表示，应用SPSS17.0软件处理，数据显著性检验用方差分析，并进行两两比较。2结果2.1细胞转染及转

7、染率的观察将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine2000以2ug：3uL，2ug：4uL，2ug：5uL及2ug：6uL转染HSC-T6，24h后均可见绿色荧光蛋白的表达，与A、B、D各组比较，C组转染率明显增高（P＜0.05见表1）。2.2不同时间点转染率的观察将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine2000以2ug：5uL转染HSC-T6后，24h即可见绿色荧光蛋白表达，48h绿色荧光蛋白表达最高，72h则有所下降，48h时转染率较24h明显增高（29.22±1.14vs19.47±4.16P＜0.05

8、），与72h比较无明显差异（29.22±1.14vs24.66±2.00t=7.764，P=0