转染金属硫蛋白基因1a促进大鼠肝星状细胞增殖

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1、转染金属硫蛋白基因1A促进大鼠肝星状细胞增殖【关键词】肝星状细胞；金属硫蛋白；增殖；肝纤维化；大鼠金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类相对分子质量低(6000～7000)、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,包括MT1、MT2、MT3、MT44个亚型，其中MT1A是MT1的主要亚型之一。它具有广泛的生物学特性，除具有对重金属的解毒作用及参与微量元素的储存、运输和代谢外，还具有增强机体的应激能力、拮抗电离辐射、清除羟自由基、调节细胞增殖和凋亡活动的作用［12］。近年来，MT与肝纤维化的关系引起了人们广泛的重视，认为其可能参与抗肝纤维化进程，而肝星状细胞（hepatic

2、stellatecells,HSCs）是研究肝纤维化的关键对象［35］。目前人们对MT在HSCs的生理病理活动过程中究竟起何作用了解甚少。本研究应用基因重组技术构建真核表达质粒MT1ApcDNA3.1转染HSCs，探讨外源MT1A对HSCs增殖的影响。1材料与方法1.1材料质粒pcDNA3.1、H5α细菌、大鼠肝细胞和HSCT6均由所在实验室保存，Trizolreagent、逆转录酶、MMLV、质粒抽提试剂盒及限制性内切酶购自TaKaRa公司,转染试剂fuGENE6购自Roche公司,兔抗大鼠MT多克隆抗体购自SantaCruz公司,兔抗大鼠Ki67抗体购自北京博奥森

3、生物技术有限公司,二抗试剂盒购自中杉金桥公司。1.2重组质粒的构建因MT在肝细胞内表达较高，故从大鼠肝细胞内抽提总RNA,RTPCR扩增MT1AcDNA,MT1A引物序列为：上游5′GCCGAATTCTGCCTTCTTGTCGCTT3′,下游5′GCCCTCGAGACGGCAAGACTCTGAG3′，由Invitrogen公司合成。PCR产物经纯化、酶切后插入pcDNA3.1质粒，构建重组质粒MT1ApcDNA3.1。重组质粒纯化后酶切及测序验证。1.3重组质粒转染HSCs及表达检测1.3.1重组质粒转染HSCs实验分为未转染组、pcDNA3.1组、MT1ApcDNA3.1

4、组。HSCs转染前1d，用含EDTA的胰蛋白酶消化细胞并计数。细胞吹打均匀后加入6孔板，密度为1×104孔-1，含10%胎牛血清的DMEM低糖培养液、37℃、5%CO2培养24h，获得50%～60%融合。以fuGENE6作为转染试剂，分别取2μgMT1ApcDNA3.1、pcDNA3.1与8μlfuGENE6共孵育20min后加入6孔板，各设4复孔，转染48h后，加含400μg·ml-1G418的DMEM筛选2～3周。随机从转染重组质粒的不同孔中挑选6个neo+耐药克隆，细胞扩增待用。1.3.2RTPCR检测HSCs中MT1A基因表达同上实验分组。取上述待用细胞加入6孔板

5、扩增，至80%融合时，Trizol试剂抽提总RNA，每样本取总RNA1μg为逆转录模板，βactin作为内参照，反应条件：94℃5min，61℃30s，72℃30s，92℃30s，共28个循环。反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用SmartvieRNA表达水平。1.3.3T1A蛋白表达同上实验分组。取上述待用细胞接种于6孔板扩增，至80%融合时，PBS冲洗2次，加入RIPA缓冲夜，收集细胞裂解液，12000r·min-14℃离心20min。取上清加热变性5min。因MT1A相对分子质量只有6000，而内参照βactin蛋白是42000，较难在同一凝胶体系电泳，故分别取50μ

6、g总蛋白加入到TrisTricine凝胶和SDSPage凝胶电泳，各自转至孔径＜0.25μmPVDF膜上，2%甲醛固定1h，PBS漂洗10min×3次，3%BSA封闭1h，加入工作浓度为1∶200antiMTIgG，4℃孵育过夜。PBST漂洗10min×4次，加有标记辣根过氧化物酶的二抗，工作浓度1∶5000，室温孵育1.5h。漂洗后ECL显色，X线曝光。1.4细胞增殖检测1.4.1AgNOR染色法同上方法培养细胞48h后冷丙酮固定，滴加AgNOR染色液室温暗处放置30min，双蒸水洗涤30min，高倍(×400)显微镜下随机选取5个视野，计数100个细胞核内平均阳性颗粒数

7、，根据颗粒数量、形态、大小等变化判断细胞增殖状态。1.4.2Ki67抗原免疫细胞化学染色各组细胞培养48h后冷丙酮固定10min，PBS液洗涤5min，加3%双氧水甲醇液室温放置10min，PBS液洗涤5min×3次，3%羊血清封闭10min后，加工作浓度为1∶200的Ki67抗体，4℃过夜，PBS液洗涤5min×3次，滴加生物素化二抗(1∶100)，37℃孵育10min。PBS液洗涤后加酶混合物(1∶100)，37℃孵育10min。洗涤后DAB显色，苏木素复染，高倍显微镜下