p53蛋白促进大鼠肝原代细胞增殖的机制

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorMechanismofP53proliferationpromotinginratprimaryhepatocytePhDcandidate：ShuzhengLiuSupervisors：Prof．GuangCaiDuan&．Prof．HenrikS．Huitfeldt(inNorway)；Collegeofpublichealth一March，2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是

2、本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：翻lb荔乏日期：护I≥年f上月f岁日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论

3、文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：纠旧善已嗍b哆年卜月明摘要1．目的：p53基因与肿瘤的发生密切相关，在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。人们普遍认为P53起到抑制细胞增殖的作用，但在肝细胞中发现抑制P53功能的同时也抑制了细胞增殖。提示P53对于细胞增殖具有促进作用。最近有文献报道P53是人源

4、性或鼠源性TGFa的转录起始因子，同时P53也可以激活MAPK途径，提示P53有促进细胞增殖作用。本研究主要探索P53促进细胞增殖的机理。2．方法：2．1细胞提取和培养雄性成年Wistar大鼠，重200"---'220克，饲养在12小时阳光12小时黑夜条件下。肝原代细胞使用改良的体外胶原酶灌注两步分离术提取。细胞死亡由台盼蓝染色计数。细胞种植密度为20000个／cm2。无血浆培养液由WilliamsMediumE培养基和Dulbecco’SmodifiedEagle’Smedium按等比例混合，最终葡萄糖浓度

5、为8．4mmol／L。培养基中加入青霉素(67mg／L)，链霉素(100mg／L)，地塞米松(25nrnol／L)矛fl胰岛素(100nmol／L)。在种植前3个小时使用5％血浆培养基培养。然后使用无血浆培养液培养在37oC，5％C02条件下。实验使用10nmol／L的EGF刺激细胞。2．2WestemBlotting检测蛋白培养的肝原代细胞使用Tris-lysisbuffer(pH7．4，含60mmol／L的Tris．HCl，10％甘油，3％的硫酸钠(SDS)，1mol／L的EDTA，0．2mmol／L的A

6、EBSF,209mol／L亮肽素，200U／mL的抑肽酶，651amol／L钒酸钠和10mmol／L的p一甘油磷酸)裂解。然后裂解液进行超声。所有样本的蛋白浓度使用DCproteinassay检测(Bio．Rad，Hercules，CA，USA)，并调整到相同浓度，最终加入D一巯基乙醇和溴酚蓝并使它l’摘要们的浓度分别为5％和O．0025％。样品煮上4分钟并贮存于-20oC条件下。样品蛋白进入凝胶电泳分离并转移至硝化纤维膜上进行随后的分析。硝化纤维膜使用含5％牛奶的Tfis-bufferedsaline溶液封

7、闭，然后使用含1％牛奶的Tris-bufferedsaline的一抗溶液4oC孵育过夜。实验中使用以下抗体：鼠源性的抗CyelinE抗体和抗P53抗体，购自CellSignallingTechnology公司，兔源性的抗CyclinD1抗体和鼠源性的抗P21抗体，购自UpstateBioteehnology公司，抗Thr202／204位点磷酸化的Erk抗体和抗CDK4抗体，购自CellSignallingTechnolog)r公司，鼠源性抗p-tubulin抗体，购自Sigma-Aldrich公司，购自Fit

8、zgerald公司，兔源性抗pYll73位点磷酸化的EGF受体抗体。冲先后，硝化纤维膜孵育二抗溶液90分钟，二抗为HRP连接的山羊源性抗兔IgG抗体和驴源性抗鼠IgG抗体及驴源性抗绵羊性IgG抗体，购自Sigma烈driCh公司。荧光使用加强的化学荧光(ECL)法检测。2．3放射渗入法检测细胞增殖肝细胞在六孔板上如上培养。细胞种植后48小时加入氚标记的胸苷(1心础)。DNA合成程度由检测到的细胞吸收