foxa3和hnj4a对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应

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1、FoxA3和Hnj4a对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应王巧燕，李丽丽，徐存拴（河南师范大学生命科学学院／河南省-科技部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地，河南新乡４５３００７）摘要：为研究ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α组合对原代大鼠肝细胞体外增殖的作用，构建了ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α基因的慢病毒载体，共转染体外培养的原代大鼠肝细胞；倒置荧光显微镜下观察转染细胞是否增殖；反转录ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ）检测外源基因和肝细胞特异基因的表达情况；ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄ－ｓｃｈｉｆｆ）染色和吲哚菁绿（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅｇｒｅｅｎ，ＩＣＧ）摄取检

2、测转染细胞功能。结果表明，慢病毒转染４ｄ后表达绿色荧光蛋白的部分肝细胞呈现上皮样形态并增殖成簇，与正常培养的肝细胞相比增殖能力明显增强；ＰＣＲ分析表明增殖的肝细胞除表达外源ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α外，还表达肝细胞的标志基因Ａｌｂ、ＣＫ１８和Ｇ６ｐ；功能检测结果表明增殖的肝细胞具有成熟肝细胞糖原合成和吲哚菁绿摄取的能力。以上结果表明，ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α能促使体外培养的原代大鼠肝细胞进行增殖，并维持肝细胞的基本生物学特性。.jyqkin。反应结束后经１％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相并观察。ＰＣＲ引物见表１。１．７ＰＡＳ反应检测大鼠肝细胞感染慢病毒１４ｄ后，取感染肝细胞进行细胞涂片，４％多

3、聚甲醛固定１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗；过碘酸水溶液作用１０ｍｉｎ，水洗；Ｓｃｈｉｆｆ试剂避光反应１０ｍｉｎ，水洗；苏木素染色１～２ｍｉｎ，水洗；分化液分化１～２ｍｉｎ，水洗后倒置相差显微镜下观察并照相。１．８ＩＣＧ摄取检测大鼠肝细胞感染慢病毒１４ｄ后，取感染肝细胞吸弃培养基，加入含１ｍｇ／ｍＬＩＣＧ的肝细胞培养基，３７°Ｃ培养箱中孵育１ｈ，ＰＢＳ洗３次，加入肝细胞培养基，倒置相差显微镜下观察细胞颜色并照相，摄取ＩＣＧ的细胞呈现绿色。２结果与分析２．１重组慢病毒载体的鉴定和滴度测定构建的重组慢病毒载体ｐＣＤＨ－ＦｏｘＡ３和ｐＣＤＨ－Ｈｎｆ４α经ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后分别获得１０６５ｂｐ（Ｆｏ

4、ｘＡ３）和１３９８ｂｐ（Ｈｎｆ４α）的片段（图１），与预期结果相符，表明构建的重组慢病毒载体是正确的。经计算浓缩后的ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α慢病毒滴度分别为６×１０７ＴＵ／ｍＬ和７．５×１０７ＴＵ／ｍＬ。２．２重组慢病毒感染肝细胞在含ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α基因的慢病毒感染原代肝细胞４ｄ后，观察到表达绿色荧光蛋白的细胞中有些增殖成簇，有些迅速凋亡。与原代肝细胞相比，增殖细胞形态呈多角的上皮样、体积变小，有较强的增殖能力。增殖的肝细胞在长期体外培养中维持稳定的形态和较高的增殖速率（图２）。２．３增殖肝细胞的ＰＣＲ检测检测增殖肝细胞中外源基因的表达情况：分别以增殖肝细胞的基因组和ｍＲＮＡ作为模板，

5、以质粒作为阳性对照进行ＰＣＲ扩增，结果表明外源基因ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α整合到增殖肝细胞的基因组中，并能正确表达（图３Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲ检测增殖细胞的肝细胞标志基因的表达情况，结果显示增殖的肝细胞表达肝细胞标志基因Ａｌｂ、ＣＫ１８和Ｇ６ｐ，ＧＡＰＤＨ为内参（图３Ｂ）。２．４增殖肝细胞功能检测ＰＡＳ染色后显微镜下可见增殖肝细胞呈紫红色阳性反应，同时ＩＣＧ摄取试验表明增殖肝细胞有摄取ＩＣＧ的能力（图４）。３讨论目前生物人工肝和肝细胞移植作为原位肝移植的替代方案，在肝脏疾病临床治疗中取得了一定的效果。肝细胞体外难以增殖且部分功能会逐渐丧失，在数量和质量上远不能满足临床需要，因此研究肝细胞体外增殖

6、有着十分重要的现实意义。ＦｏｘＡ３是起始肝脏发育的“先锋因子”、能调节肝特异基因表达和维持血糖平衡［１６－１８］；Ｈｎｆ４α参与哺乳动物肝脏发育过程中肝细胞的分化和形态形成，而且对于成体肝脏的代谢调节和功能维持是必需的［１９，２０］。研究表明ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α还能调控终末分化细胞向肝样细胞的转分化，Ｆｏｘａ１＋Ｈｎｆ４α、Ｆｏｘａ２＋Ｈｎｆ４α、Ｆｏｘａ３＋Ｈｎｆ４α、Ｇａｔａ４＋Ｈｎｆ１α＋Ｆｏｘａ３组合均能使小鼠成纤维细胞转分化为肝样细胞［１３，２１］；ＦＯＸＡ３＋ＨＮＦ１Ａ＋ＨＮＦ４Ａ组合还能诱导人成纤维细胞转分化为肝样细胞［２２］。然而ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α对肝细胞体外增殖的作

7、用研究还未见报道。因此本研究通过构建ｐＣＤＨ－ＦｏｘＡ３和ｐＣＤＨ－Ｈｎｆ４α重组慢病毒载体并共转染体外培养的原代大鼠肝细胞，从而探究ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α组合对原代大鼠肝细胞体外增殖的作用。结果表明，肝细胞感染ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α慢病毒后增殖能力明显增强，外源基因ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α整合到增殖的肝细胞基因组中并表达，外源基因没有被沉默，这与Ｓｅｋｉｙａ等［１３］的研究结果一致。ＲＴ－ＰＣＲ结果还显示增殖的肝细胞表达