佐米曲坦对大鼠原代肝细胞PXR 的激活作用

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1、佐米曲坦对大鼠原代肝细胞PXR的激活作用摘要细胞色素P4503A(cytochromeP4503A,CYP3A)是细胞色素P450超基因家族中最重要的一类代谢酶，体内含量很高，在肝脏和小肠中都有分布。CYP3A是催化很多内源性和外源性化学物质代谢的主要酶系,其底物相当广泛，一半以上的临床用药由其参与代谢，在药物相互作用中有很重要的作用。CYP介导的解毒作用是机体保护自身不受外来物质损伤的重要防御机制。孕甾烷X受体（PXR）是孤儿核受体家族成员之一，近年来一系列研究发现，PXR作为关键的转录调控因

2、子参与CYP3A基因的诱导表达。PXR是个泛宿主性的受体，目前研究已经表明许多结构不同的化合物都能通过激活PXR而诱导CYP3A的表达，包括外源性物质和内源性甾体物质，如糖皮质激素地塞米松、PCN和抗菌药利福平等。PXR的激活可保护机体对抗外来毒物的侵害。佐米曲坦（zolmitriptan,C16H21N3O2）是一种高选择性5－HT1B/1D受体激动剂，临床上用于偏头痛的治疗。本品通过中枢作用，抑制脑干中疼痛的传递；通过作用于外周神经，本品收缩颅血管，并抑制血管活性肽的释放和神经原炎症。本实验

3、研究佐米曲坦对大鼠PXR受体的激活作用，对阐明佐米曲坦对大鼠CYP450的诱导作用的机制具有重要意义。本文通过构建大鼠CYP3A1和CYP3A2启动子基因（含PXR的DNA结合区域（DBD））的PGL3载体，然后将其和对照质粒共转染至大鼠原代培养肝细胞中，6h后换液，在细胞培养基中加入佐米曲坦，孵育24h后通过检测荧光强度获得结果，实验中以地塞米松和PCN作为阳性对照，溶剂DMSO作为阴性。目的：本实验通过PCR扩增得到CYP3A1和CYP3A2启动子基因序列（含PXRDNA结合区域（DBD），

4、重组至含荧光素报告基因的PGL3-Basic载体上，构建PGL3-3A1/2P质粒，建立大鼠原代培养肝细胞重组PGL3-Basic质粒模型，从而研究佐米曲坦对大鼠CYP3A诱导作用的机制及佐米曲坦性别差异性诱导大鼠CYP3A表达的作用机制。方法：本实验以大鼠肝脏总DNA为模板，通过PCR法扩增CYP3A1/2启动子基因序列。通过TA克隆，连接PMD18载体和CYP3A1/2启动子基因片段构建克隆载体，转化大肠杆菌DH5α细胞，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定确定CYP3A1/2启动子基因序列。将CY

5、P3A1/2启动子基因片段插入PGL3-Basic载体的多克隆位点(XhoI，MluI)，通过酶切鉴定连接。PGL3-3A1/2P质粒与对照质粒pRL-TK,大鼠PXR表达质粒rPXR-pcDNA共转染至新鲜制备的大鼠原代肝细胞，转染6h后换液给药，24h后检测荧光强度。结果：DNA测序鉴定正确，PGL3-3A1/2P质粒（多克隆位点XhoI，MluI）和rPXR-PCDNA质粒（多克隆位点EcoRI，HindIII）构建成功。Dex、PCN的阳性对照明显，且Dex的诱导作用比PCN稍强，中浓度

6、的佐米曲坦对大鼠CYP3A1和CYP3A2的诱导作用比低浓度和高浓度的明显，但实验的重现性不佳。佐米曲坦大鼠CYP3A诱导作用的机制及性别差异性由于时间关系还有待继续研究。结论：CYP3A1/2启动子基因片段插入PGL3-Basic载体的多克隆位点XhoI、MluI，PGL3-3A1/2P质粒构建成功，可用于转染大鼠原代培养肝细胞。研究佐米曲坦对大鼠PXR的激活作用，从而阐明佐米曲坦诱导大鼠CYP3A的作用机制。【关键词】佐米曲坦；PXR；PGL3-3A1/2P；质粒构建；原代肝细胞；共转染In

7、ductionofPXRinprimaryculturedrathepato-cytesbyzolmitriptanAbstractCytochromeP4503Aenzyme（CYP3A）,themostabundantCYPisoform,isthemostimportantmetabolicenzymeinCytochromeP450superfamilyandmainlylocalizedontheliverandintestine.CYP3Aisthemainenzymesystemc

8、atalyzingthemetabolismofmanyendogenousandxenobiotics.ThesubstratesofCYP3AarewidespreadandoverhalfofdrugsusedinclinicaremetabolizedbyCYP3A.CYP3Aalsoappearstobeakeyenzymeindrug-druginteractions.ThedeintoxicationregulatedbyCYPisanimportantdefensemechani