il10对大鼠原代肝细胞增殖的影响

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1、IL10对大鼠原代肝细胞增殖的影响：林羡屏,黄月红,郑伟达,陈运新,陈治新,王小众【摘要】　　目的:探讨IL10对体外培养大鼠原代肝细胞增殖的影响。方法:胶原蛋白酶原位灌流法分离大鼠肝细胞,RTPCR法检测肝内不同细胞标志基因的表达情况,对比原代肝细胞与大鼠正常肝组织的检测结果,进行细胞纯度鉴定;RTPCR法检测原代肝细胞IL10和IL10受体α（IL10Rα）的表达情况;原代肝细胞分3组培养:正常组（N组）、对照组（C组）和IL10干预组（I组）;通过MTT分析、台盼兰细胞计数以及流式细胞术检测DNA

2、含量等方法,了解外源性IL10对肝细胞增殖的影响。结果:细胞鉴定结果显示,所有的标志基因在肝组织都可检测到有较高的表达,原代肝细胞虽高表达肝细胞标志基因,而肝内其他细胞的标志基因则不表达或低表达。RTPCR检测显示原代肝细胞可表达IL10和IL10Rα。台盼兰细胞计数提示IL10干预48h,I组平均细胞数仅为C组的71.96%（P<0.05）;MTT检测亦显示IL10干预24、48h,I组吸光度值分别为C组的88.41%与90.24%（P<0.05）;流式细胞术检测结果表明IL10干预24h,

3、I组肝细胞峰DNA含量是C组的59.06%,I组较C组降低(P<0.01),甚至低于N组(P<0.01)。结论:分离的原代肝细胞纯度较高,大鼠原代肝细胞表达IL10/IL10RmRNA,IL10抑制大鼠原代肝细胞增殖。【关键词】原代肝细胞;IL10;IL10R;细胞增殖　　白细胞介素10（interleukin10,IL10）是一种抑制性细胞因子,具有抗炎症作用,IL10受体α(IL10Rα)介导IL10参与各种各样的效应。IL10对治疗许多肝脏疾病如肝纤维化,有着良好的应用前景,动物模

4、型实验已证实外源性IL10具有减轻肝脏炎症损伤和肝纤维化的作用［1-3］。IL10与肝纤维化相关研究的对象,主要是放在HSC、KC等细胞,对肝细胞的研究相对较少;部分学者从组织学、血清学水平研究IL10对肝细胞的作用,针对性不足,要阐明作用机制还远远不够。基于以往对大鼠原代HSC和肝纤维化的研究［3］,我们将分离大鼠原代肝细胞,检测大鼠原代肝细胞IL10/IL10RαmRNA的表达,流式细胞术检测及MTT实验等方法研究IL10对肝细胞增殖的影响。　　1材料和方法　　1.1材料SD大鼠（4只,雄性,重250～

5、300g）,购自上海实验动物中心;重组大鼠IL10（深圳晶美生物工程公司）,IV型胶原酶（Sigma公司）,DMEM培养基干粉购自Gibco公司,小牛血清购自杭州四季青公司,细胞周期试剂盒购自北京天来生物医学科技有限公司,MTT购自Fluka公司,台盼兰购自上海捷倍思基因技术有限公司。RNA抽提试剂盒（美国Gentra公司）;AMV逆转录试剂盒由（美国Promega公司）;IL10/IL10Rα引物及相应PCR试剂盒（TaKaRa公司）;其余引物（生工生物工程公司）,相应PCR试剂盒（美国Promega公司）;流

6、式细胞仪（COULTEREPICSXL,Backman公司）。　　1.2方法　　1.2.1肝细胞的分离、鉴定、培养和冻存取正常SD大鼠,采用胶原蛋白酶原位灌流法分离出肝细胞,具体操作方法见参考文献［4］,PAS染色鉴定显示肝细胞纯度,台盼兰拒染法计数活细胞比例,按常规细胞冻存方法,冻存肝细胞于液氮罐中备用［5］,使用前培养于含10mL/L胎牛血清的DMEM培养液中。　　1.2.2原代肝细胞鉴定分离得到的原代肝细胞以及新鲜肝组织块,抽提总RNA,RTPCR法检测肝细胞和肝内其他主要细胞的标志基因表达,相鉴别的细胞和

7、相应的鉴别标志基因如下,肝细胞白蛋白、甲胎蛋白(AFP)和细胞色素P450基因CYP2B1和CYP2B2;胆管细胞CD19,内皮细胞CD31,Kupffer细胞CD68［6,7］,肝内产胶原细胞如星状细胞前胶原酶I（preCollagenI,PCI）。抽提细胞总RNA、逆转录、PCR、凝胶电泳成像的方法步骤参考［8］;此外结合原代肝细胞PAS染色观察糖原颗粒,辅助鉴别。引物序列:Albumin:F:5′TTGCCAAGTACATGTGTGAG3′;R:5′GGTTCTTCTACAAGAGGC

8、TG3′;373bp.CK19:F:5′GACTTCCTATAGCTATCGCC3′;R:5′TCTGGTACCAGTCGCGAATC3′;359bp.AFP:F:5′TGAAATTTGCCACGAGACGG3′;R:5′TGTCATACTGAGCGGCTAAG3′;272bp.CYP2B2:F:5′GAGTTCTTCTC