大鼠原代肝星形细胞的分离与鉴定.pdf

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1、第32卷第1期广西师范大学学报：自然科学版Vo1．32No．12014年3月JournalofGuangxiNormalUniversity：NaturalScienceEditionMar．2O14大鼠原代肝星形细胞的分离与鉴定曾淑兰，安运锋，卢超，张立杰，张国海(广西师范大学化学与药学学院，广西桂林541004)摘要：本文通过二步原位灌注的方法分离得到大鼠肝脏，随后通过机械剪切，用0．2g／l链霉蛋白酶E，0．2g／L胶原酶Ⅳ以及0．1g／LDNaseI消化和分散，筛网过滤、经130g／LNycodenz密度梯度离心后收集肝星状细胞，经台盼蓝染色后用细胞计数仪鉴定细胞存活率，a—s

2、MA(平滑肌动蛋白)免疫细胞化学染色法鉴定肝星状细胞纯度。结果显示，肝星状细胞的得率为每个肝脏3．5×1O个细胞以上，肝星状细胞纯度为95左右，肝星状细胞存活率为(97．0士3．2)，满足实验需要。关键词：肝星状细胞；细胞分离；原代培养；鉴定中图分类号：R735文献标识码：A文章编号：1O0卜6600(2014)01-0123—04肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)，又称肝储脂细胞、维生素A储存细胞、Ito细胞、窦周细胞，正常情况下表现为富含VitA脂滴的静止型，又称静息态(quiescent)l1]。正常肝组织中的HSC为静息态，与肝纤维化无关，在各种肝损伤

3、因素的刺激下，静息态的HSC会转变为激活态的HSCl2。激活态的HSC会分泌多种细胞因子，形成细胞因子的调解网络，这些因素一方面会激活其他静息态的HSC并使其大量增殖，另一方面使激活的HSC快速转变为MFB(myofibroblast)，从而合成大量的ECM(extracellularmatrixc)，并使得ECM的合成与降解发生紊乱，最终导致大量ECM积聚，从而引发肝纤维化L3]。鉴于HSC在肝纤维化中的重要作用，分离高纯度的原代HSC成为肝纤维化研究的基础工作之一。本研究在参考国内外文献的基础上，反复摸索确立一种快速、稳定的分离方法。1材料与方法1．1实验材料1．1．1实验动物Wi

4、star大鼠，雄性，SPF级，体质量(350±10)g，由复旦大学上海医学院动物实验中心提供。1．1．2试剂DMEM购自Invitrogen，胎牛血清(FBS)购自Hyclone，链蛋白酶购自Roche，肝素钠、胶原酶、Nycodenz均购自Sigma，烟碱酰胺购自碧云天，戊巴比妥钠购自国药集团，DNaseI购自华美生物。1．1．3试验设备蠕动泵，生物安全柜(Thermo)，CO培养箱(Thermo)，倒置显微镜(Nikon)，高速冷冻离心机(Eppendorf)，水浴锅，超净工作台，恒温摇床，细胞计数仪(TC10)。1．1．4灌注液和酶消化液第一灌注液采用D-Hanks液(含2U／m

5、L肝素钠)，第二灌注液为含酶Hanks液(0．5g／I胶原酶、收稿日期：2013—09—30基金项目：广西自然科学基金资助项目(2O13GXNsFBAO19159)；广西医药产业人才小高地基金资助项目(1309，1312)；药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室主任基金资助项目(CMEMR2012-A15)；地方高校国家级大学生创新训练基金资助项目(201210602022)通信联系人：张国海(1984一)，男，山东聊城人，广西师范大学助理研究员。E—mail：zhangguohaiwansui@126．cornl24广西师范大学学报：自然科学版第32卷1g／I链霉蛋白酶、体积分数

6、为5的FBS)，消化液(含酶Hanks液、含0．2g／I胶原酶、0．2g／I链霉蛋白酶、0．1g／IDNaseI、体积分数为5的FBS)，含DNaseIDMEM液(0．1g／IDNaseI)，130g／INycodenz液(用不含NaC1的GBSS溶液配制)，30g／I戊巴比妥钠，肝素钠溶液(2500U／mL)。上述溶液均采用抽滤除菌。1．2实验方法1．2．1动物处理实验前大鼠禁食12h，称量后腹腔注射30g／I戊巴比妥钠(用量为lmI／kg)，并将其固定于灌流盘内；待大鼠被基本麻醉后，剪掉腹部毛，用酒精将其全身反复消毒后带人生物安全柜；沿腹中线从泄殖孔前至颌底将大鼠胸腹腔剖开，再剪开

7、颈部右侧，便于灌流液能由此流出而不会滞留于胸腔内；用无菌纱布包住身体皮层剖开的四角，用血管钳固定，以免污染，暴露出大鼠大腿的股静脉，注射0．5mL肝素钠溶液；翻开小肠，沿肠系膜找到肝门静脉(肝门静脉位于肠系膜上的血管与肝脏汇合处，为暗红色)，在门静脉距肝门约1．5cm处预留两根缝线，用于结扎。1．2．2灌注处理事先在水浴锅内(42℃)对DHanks液进行持续预热，在开始灌注D—Hanks液的同时迅速剪断下腔静脉，开始时流速为30mI／min，约