survivin反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

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1、Survivin反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究作者：段体德1，刘德权2，杨策尧1【摘要】目的探讨Survivin反义核酸技术诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及效果。方法本实验共分6组，分为以脂质体介导反义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及RPMI1640培养液的空白对照组，转染人乳腺癌MCF-7细胞系，应用Hoechst33258/PI双重染色观察MCF-7细胞的形态学改变，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化，DNA凝胶电泳观察凋亡情况，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果Hoechst33258/PI染色及透射电镜观察可见转染

2、后的细胞结构呈凋亡样改变；流式细胞仪检测见转染后细胞凋亡显著增加，并出现G2/M期阻滞现象；DNA凝胶电泳在600ng/ml，800ng/mlASODN/Lip组的电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象。结论凋亡抑制基因Survivin表达下调对乳腺癌细胞的生长抑制作用主要是通过诱导细胞发生凋亡以及阻止有丝分裂发生在G2/M阻滞期来实现，Survivin靶向反义核酸技术可能成为乳腺癌基因治疗的一种有效方法。【关键词】乳腺癌；Survivin基因；反义核酸技术；凋亡14/14【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectofcellsapoptosisonhuman

3、breastcanceraftersurvivinwasblockedwiththeantisensetechnique.MethodsTheexperimentswerepidedintosixgroups.AntisenseOligonucleotide，nonsenseoligonucleotidewastransfectedinhumanbreastcancerMCF-7celllineandRPMI1640culturemedium.ThestudyusedHoechst33258/PI，electronmicroscope，flowcytometerandingelelect

4、rophoresisofDNAtoobservethecellsapoptosis.ResultsThecellsapoptosisaftertransfectionwereobservedbyHoechst33258/PI，electronmicroscopeandingelelectrophoresisofresultofflowcytometershowedthecellsapoptosisaftertransfectionandtheblockingphenomenaappearedinG2/Mperiod.ConclusionTherestrictionbythereducti

5、onofsurvivinexpressioninbreastcancercellsismainlyfunctionedthroughitsinductionofcellsapoptosisandpreventionofmitosisatG2/Mperiod.Survivintargetingtherapy14/14canbeusedasanimportantmethodinbreastcancertreatment.【Keywords】breastcancer；survivingene；antisensetechnique；apoptosis现代分子生物学研究发现与细胞恶性增殖和分化受阻

6、一样，细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上亦占有重要地位。诱导肿瘤细胞发生凋亡目前正逐步成为治疗恶性肿瘤的一种重要的治疗方法，具有较高的选择性与靶向性。Survivin是近年来发现的一个新的细胞凋亡抑制基因，能够抑制肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞得以生存，在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因是肿瘤基因治疗的主要方法。在本实验研究中我们应用荧光染色、电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等技术，从细胞形态学到细胞周期、DNA变化，从定性到定量进行了研究。探讨是否可通过转染Survivin反义寡核苷酸诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡，为乳腺癌的基因治疗提供理论实验依据。1材料与方法细胞

7、培养14/14MCF-7人乳腺癌细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。将加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液制成的细胞悬液，镜下计数，调节细胞至约1×106个/ml，分别接种于30ml培养瓶、96孔培养板及铺有盖玻片的6孔培养板，37℃，5%CO2常规培养至80%汇片后进行转染。脂质体介导SurvivinASODN转染MCF-7细胞寡核苷酸的设计及合成采用SurvivinmRNA231-251设计互补ASODN，反义寡核苷酸