蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究作者：王菊香，郑海萍，裴士庚，门金娥，张向阳【摘要】　　目的探讨蜂胶对喉癌细胞珠Ｈep-2凋亡的影响及作用机制。方法用流式细胞仪、原位末端标记法、激光共聚焦显微镜等技术，观察蜂胶对细胞的抑制、凋亡情况及细胞内Ca2+变化。结果蜂胶能抑制Hep-2细胞的生长、诱导喉癌细胞凋亡，非特异性地阻滞Hep-2细胞周期的全过程。原位末端标记检测出细胞凋亡率亦有时间、剂量依赖性。细胞内Ca2+随蜂胶浓度的增加而升高，且具有统计学意义

2、。结论蜂胶能够抑制喉癌细胞生长，其抑制作用是通过诱导喉癌细胞凋亡而起作用的。【关键词】蜂胶；Hep-2细胞；细胞凋亡目前，喉癌的治疗是以手术为主的综合治疗，化疗是其中重要的组成部分，用于喉癌的化疗药物尚缺乏理想的选择性。蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树木的枝条上采集树脂类物质，与其唾液混合加工成一种芳香性胶状固体物，含有多种黄酮、槲皮素、肉桂酸衍生物、多糖、氨基酸等有药理活性的化合物［1］。它不仅具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎、护肝等作用，还具有抗肿瘤作用。为进一步探讨其抗癌作用机理，我们观察了蜂胶对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响。现报道如下。课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结

3、果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果1材料蜂胶提取物取本地产蜂胶，冰冻粉碎后以95%乙醇浸泡7h，过滤，滤液于40℃减压挥干溶剂，二甲基亚砜溶解定容为mg/ml。试剂及仪器RPMI1640培养液为美国GIBCO公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BECTONDICKINSON公司产品；POD试剂盒购自华美生物工程公司；MRC-1024激光共聚焦显微镜。细胞株人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株由白求恩国际和平医院耳鼻喉

4、头颈外科实验室惠赠。　2方法.1蜂胶浓度分组实验前用RPMI1640(Gibco公司)将蜂胶提取物稀释成20，40，80，160μg/ml，DMSO的浓度低于%。.2流式细胞仪检测收集对照组和80μg/ml蜂胶作用不同时间(24，48，7h)的细胞，用PBS洗涤2遍，经柠檬酸缓冲液固定1h以上，上机前加100μl胰酶消化液充分作用，加入100μl碘化丙啶(PI)作用1min以上，过滤，上机进行细胞凋亡分析和细胞周期分析。.3原位末端标记法(TUNEL)定量检测分别于各剂量药物作用后24，48，7h收集细胞，PBS洗2次，细胞涂片，室温干燥。按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用普通

5、光镜计算课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果凋亡率(AI)。计算方法：随机选取5个高倍视野，分别计阳性细胞数及总细胞数，代入下式：AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。.4Hep-2细胞内Ca2+变化的激光共聚焦显微镜检测对数生长期Hep-2细胞，用D-Hanks液洗涤2次，于37℃避光条件下Fluo-3/AM荷载。40min后用D-Hanks液洗涤细胞3次，洗去细胞外残余染料

6、，最后保留少许细胞外D-Hanks缓冲液，平衡10min。经不同浓度蜂胶作用不同时间，在激光共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长48nm，发射波长52nm，以本底荧光强度为参照，检测细胞内Ca2+荧光强度。.5数据统计学处理采用统计软件进行统计处理，计量资料用±s表示，比较时采用t检验。α=。结果.1流式细胞仪检查结果80μg/ml蜂胶对Hep-2细胞凋亡率的影响：24，48，7h时Hep-2细胞抑制率分别为%，%，%，时间越长细胞凋亡率越高。24，48，7h时G0/G1期细胞分别占%，%，%；S期分别占%，%，%；G2/M期分别占%，%，%。.2TUNEL标记各组细胞凋亡率明

7、显升高，与同时间对照组比较差异有显著性，且呈现一定的时间、剂量依赖性。见表1。表1不同浓度、不同时间蜂胶作用的Hep-2的细胞凋亡率比较与对照组比较，*P4讨论课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果　　蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树干上采集的树脂，并混入其