新城疫病毒体外诱导s180细胞凋亡的实验研究

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1、新城疫病毒体外诱导S180细胞凋亡的实验研究：蒋丽娜孙黎程建贞罗强翟登高【摘要】目的：探讨新城疫病毒(NeL和1×106/mL分别接种于96孔板和50mL培养瓶中，加入不同浓度的NDV(1∶20、1∶10、1∶5)作用24h，分别用MTT法检测NDV对S180瘤细胞的生长抑制作用,荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：经上述不同浓度的NDV作用24h，对S180细胞生长的抑制率依次为10%、26%、39%，各实验组吸光度值（A490）与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。荧光显微镜观察实验组培养的S180瘤细胞，出现细胞核固缩及凋亡小体

2、，琼脂糖凝胶电泳见DNA梯形条带。结论：NDV对体外培养S180细胞增殖有明显抑制作用，可诱导S180细胞凋亡。【关键词】新城疫病毒；细胞凋亡;电泳/琼脂凝胶【ABSTRACT】Objective:ToinvestigateL）idexponentialphaseandplantedin96Lculturebottles,1.5mLeach.ThecellseasuredbyMTTmethod.Apoptosisicroscopyorphology，agaroseelectrophoresisicroscope.DNAfragmentL注入尿囊腔内培养72h

3、，取出鸡胚4℃冰箱过夜。次日收集尿囊液，按常规血凝实验方法检测血凝效价，NDV为1∶800（++），所有病毒存于-80℃备用。1.1.2细胞株小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞由河北医科大学实验动物部提供。1.1.3试剂四甲基氮噻唑蓝（MTT）为北京市普京康生物工程技术有限公司进口分装产品。DMEM培养基为美国Gibco公司产品。新生牛血清购自天津市川页生化制品有限公司。凯基AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒为深圳晶美生物有限公司产品。琼脂糖、100bpDNA标志物购自郑州羚锐制药有限公司。其他试剂为国产分析纯。1.1.4仪器酶标仪（美国StatFax

4、2100），荧光显微镜（日本Olympus），流式细胞仪（美国FACSAria），紫外投射仪（ZF型，上海康华生化仪器制造厂）。1.2方法1.2.1细胞培养小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞株经小鼠腹腔传代，无菌抽取腹水瘤细胞,置于含15%灭活胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2培养箱中进行培养,当细胞生长至对数期加入不同浓度的NDV处理。1.2.2MTT比色法观察S180瘤细胞抑制率取对数生长期浓度为5×104/mL的S180瘤细胞，接种于96孔培养板上，每孔100μL。用DMEM培养液把病毒稀释成1∶20、1∶10、1∶5三个不同浓度，并分别加入96

5、孔培养板（100μL/孔），每组设4个重复孔，对照组加入等体积培养液，均培养24h。实验终止前4h每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，培养结束时用吸管轻轻吸弃上清夜，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100μL，15min后以酶标仪检测吸光度（A490值），按公式计算S180细胞抑制率。抑制率（%）=（1-实验组平均A490值/对照组平均A490值）×100%。2008年6月蒋丽娜等：新城疫病毒体外诱导S180细胞凋亡的实验研究第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期1.2.3荧光显微镜观察S180瘤细胞凋亡取对数生长期S180细胞（浓度为1×10

6、6/mL）分别接种于4只50mL的培养瓶，每瓶1.5mL，实验组分别加入上述不同浓度的病毒液1.5mL，对照组加入1.5mL的培养基。培养24h后，1500×g离心7min，收集S180细胞，严格按照凯基AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行，荧光显微镜观察凋亡细胞并拍照（图2）。1.2.4琼脂糖凝胶电泳分析按1.2.3方法收集S180细胞，用PBS洗涤3次，最后一次移入1.5mLEP管中，加裂解液615μL70℃水浴震荡15min，15000g离心15min重复2次，取上清液500μL加1000μL的无水乙醇使DNA析出，15000g离心1

7、5min，最后用20μLTE缓冲液（pH=7.4）溶解DNA。电泳前，用RNA酶（10g/L）消化30min，2%琼脂糖凝胶电泳60min，EB染色，紫外透射仪观察并拍照（图3）。1.3统计学分析所有数据均采用SPSS12.0统计软件进行分析。各组实验统计资料以均数（x±s）表示，组间显著性差异采用t检验馈。2结果2.1NDV对S180瘤细胞增殖的抑制作用分别以1∶20、1∶10、1∶5三个不同浓度的病毒液作用S180细胞24h，对S180细胞的生长有不同程度的抑制作用，且随着病毒浓度的增加，对S180细胞抑制率也增加，分别为10%、26%、39%，各实验组A

8、490与对照组比较差异均有统计学意义（