沙门菌体内耐药诱导模型的建立及体外诱导耐药菌rna-seq分析

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1、AnhuiAgriculturalUniversityDrug-resistanceInducingModelinvivoofSalmonellaenterica-CaenorhabditiselegansandTranscriptomeSequencingAnalysisoftheInducingDrug-resistanceSalmonellaentericainvitroGraduate：FengShuaiAdvisorProfessor：Pro.LiLinAcademicDegreeAppliedFor

2、：MasterofAgricultureMajor：BasicVeterinaryScienceResearchDirection：VeterinaryPharmacologyandToxicologyInstitution:CollegeofAnimalScience&TechnologyMay,2015国家自然科学基金资助项目:沙门菌转录激活子介导的氟喹诺酮类耐药机理研究项目编号：31201957摘要沙门菌是一类常见的人畜共患病原菌，绝大多数对人和动物致病，可造成人和动物的伤寒、副伤寒、败血症和食物中毒等疾

3、病，是公共卫生的重要威胁。随着氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones，FQs）的普遍使用，沙门菌对FQs的耐药水平不断升高，耐药问题日益严重。目前通常使用FQs对敏感菌进行体外诱导来研究耐药机制，但是体外诱导并不能确切反映沙门菌在体内时的耐药性产生机理，因为动物体内是复杂的生物环境，机体的代谢、免疫机制等都可能会对细菌的耐药机理产生影响。本研究以秀丽隐杆线虫N2野生型为宿主，将鼠伤寒沙门菌ATCC13311定植于线虫体内，然后使用梯度浓度递增法提高培养液中的环丙沙星浓度，诱导在线虫体内的沙门菌产生耐药

4、性，同时进行体外诱导耐药实验。分别扩增体内诱导和体外诱导耐药菌的gyrA、gyrB、parC和parE基因的氟喹诺酮耐药决定区（Quinoloneresistancedeterminingregions，QRDR）以及外排泵抑制子基因（acrR、marR、ramR和soxR），对PCR扩增产物进行测序和分析。然后分别构建鼠伤寒沙门菌ATCC13311和体外诱导耐药株的转录组测序文库并进行IlluminaRNA-seq双向测序，对ATCC13311和体外诱导耐药菌的转录组测序结果进行数据分析。最后采用荧光定量PC

5、R技术对转录组测序结果进行验证。结果表明，鼠伤寒沙门菌ATCC13311可以稳定定植于线虫体内，在线虫消化道内集中分布于咽部和肠道，经过环丙沙星诱导后可产生稳定耐药菌株。经过诱导后得到环丙沙星MIC为4μg/mL的耐药菌TN4，体外诱导实验获到了环丙沙星MIC为4μg/mL的耐药菌TW4。TN4的gyrA基因发生了Asp87Asn突变。体外诱导耐药菌TW4的gyrA基因发生了Ser83Phe和Asp87Val突变，ramR基因出现了20bp的缺失。对ATCC13311和体外诱导耐药菌TW4进行RNA-seq测序

6、后获得了4.46G有效数据，通过denovo拼接，获得了311条unigene，平均长度为15587bp。拼接所得到的全序列长度为4847532bp，经预测4998条基因中有4902条得到GO注释。采用COG功能将注释基因划分为25类，共有3735个基因得到注释。将TW4与ATCC13311相比较，有3434个基因表达量显著上升，32个基因表达量显著下降，7条代谢途径表达差异显著。对表达量改变明显的基因进行统计，发现22个与耐药直接相关或者与药物转运系统相关基因表达量显著上升。荧光定量PCR结果显示acrB、a

7、crD和soxS的基因表达量与RNA-seq结果趋势一致，证实RNA-seq可靠。本研究建立了鼠伤寒沙门菌-秀丽隐杆线虫体内耐药性诱导模型，并比较了体内诱导耐药菌和体外诱导耐药菌的基因突变差异。利用转录组测序技术（RNA-seq）对I鼠伤寒沙门菌ATCC13311和其诱导耐药株TW4进行研究，揭示了鼠伤寒沙门菌耐药性诱导前后差异表达的基因和显著变化的代谢途径，为深入研究细菌耐药机制及与细菌代谢途径之间的联系提供重要依据，为进一步研究生物体内的细菌耐药机理奠定了基础。关键词：鼠伤寒沙门菌，秀丽隐杆线虫，耐药性，体

8、内诱导，转录组测序IIAbstractSalmonellaisacommontypeintheproductionprocessandtheclinicaltreatmentofzoonoticpathogens,thevastmajorityofitarepathogenictomanandanimal.Typhoid,paratyphoidfeverandsepsiswerecau