槲皮素对铁和酒精联合诱导的肝细胞氧化损伤与铁代谢相关基因表达的影响

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1、·华中科技大学硕士学位论文槲皮素对铁与酒精联合诱导的肝细胞氧化损伤及铁代谢相关基因表达的影响研究生：邓玥导师：姚平副教授摘要第一部分槲皮素对铁与酒精联合诱导的肝细胞氧化损伤及LIP-Fe的影响目的：以乙醇孵育的大鼠原代肝细胞为研究模型，通过酶学与生化分析，系统观察槲皮素干预后乙醇代谢与铁应激状态下肝细胞氧化损伤相关指标及可变铁池（Libleironpool，LIP-Fe）的变化，探讨槲皮素的潜在保护效应。方法：1、采用两步胶原酶灌流技术分离培养大鼠原代肝细胞，经不同剂量的外源性铁剂次氮基三醋酸铁胺（Fe-NTA，5~100µmol/L）处理24h，检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（lactat

2、edehydrogenase，LDH）与谷草转氨酶（aspartatetransaminase，AST）活性、细胞超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）与谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平、活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，以观察不同浓度Fe-NTA染毒后肝细胞氧化损伤程度变化，选择Fe-NTA适宜的染毒剂量。2、根据上述研究确定的Fe-NTA染毒剂量（50µmol/L）对乙醇（200mmol/L）孵育的大鼠原代肝细胞联合染毒，观察同期槲皮素（100µmol/L）干预后上述

3、氧化应激相关指标的变化，评价槲皮素对酒精与铁联合应激所致氧化损伤的保护作用。1····华中科技大学硕士学位论文3、乙醇（200mmol/L）孵育的肝细胞，经Fe-NTA（50µmol/L）、槲皮素（100µmol/L）单独或联合处理24h后，通过钙黄绿素分光光度法测定细胞内LIP-Fe水平，比较槲皮素干预对乙醇与高铁联合染毒后肝细胞内LIP-Fe水平的影响。结果：1、与正常对照组相比，随着Fe-NTA剂量的增加，细胞内AST、LDH的释放逐渐增多，SOD活性逐渐下降，GSH耗竭加重及MDA水平上升，表现出剂量-效应关系。同酒精对照组相比，浓度低于50µmol/L的Fe-NTA与酒精共同作用时

4、联合氧化毒性不明显。而浓度达到50µmol/L的Fe-NTA与乙醇共同孵育时，肝细胞AST与LDH释放急剧上升，GSH消耗严重及MDA水平升高，ROS生成急剧增多，表现出显著的联合毒作用。2、与正常对照组相比，乙醇、Fe-NTA（50µmol/L）的单独处理，均表现出AST与LDH的释放增多，GSH水平和SOD活性下降，MDA水平升高以及ROS生成明显增多。槲皮素处理后，与酒精对照组相比，LDH和AST释放明显减少，GSH水平和SOD活性均有上升，MDA水平下降及ROS生成减少。对乙醇和Fe-NTA联合处理的肝细胞进行槲皮素干预，与乙醇和Fe-NTA联合处理组相比LDH和AST释放明显下降，

5、GSH水平和SOD活性升高，MDA水平下降及ROS生成显著减少。3、与正常对照组相比，乙醇和Fe-NTA染毒的肝细胞中LIP-Fe水平均有明显升高，而二者的联合作用下，LIP-Fe水平异常升高；槲皮素干预，较之正常对照组，LIP水平无明显变化；对乙醇和Fe-NTA联合处理的肝细胞进行槲皮素干预后细胞LIP-Fe水平明显降低。结论：铁染毒剂量的增加加剧肝细胞酒精性氧化损伤，表现出剂量-效应关系和氧化协同毒性。槲皮素干预有效抑制酒精和铁联合诱导的肝细胞氧化损伤和LIP-Fe水平升高。关键词：酒精；铁负荷；槲皮素；氧化损伤；可变铁池2····华中科技大学硕士学位论文第二部分槲皮素对铁与酒精联合应激

6、下肝细胞铁代谢相关基因表达的影响目的：大鼠原代肝细胞为研究对象，观察槲皮素干预对酒精孵育和铁负荷下肝细胞hepcidin、膜铁转运蛋白（ferroportin）、转铁蛋白受体（transferrinreceptor1,TfR1）及转铁蛋白受体2（transferrinreceptor2,TfR2）等铁代谢调控基因表达的影响，探讨槲皮素防治肝细胞酒精性铁过载的可能机制。方法：乙醇（200mmol/L）和Fe-NTA（50µmol/L）联合孵育的大鼠原代肝细胞，经槲皮素（100µmol/L）处理24h后，采用荧光实时定量PCR法（real-timePCR）测定肝细胞内hepcidin、ferro

7、portin、TfR1及TfR2mRNA表达变化，同时以乙醇（200mmol/L）、Fe-NTA（50µmol/L）单独或联合处理肝细胞作为对照，观察槲皮素干预对铁代谢相关基因表达的影响。结果：1．与正常对照组相比：乙醇处理后大鼠原代肝细胞hepcidin和TfR2mRNA表达下降，TfR1和ferroportin表达升高；Fe-NTA处理后肝细胞hepcidin表达明显升高，ferroportin表达变化不