槲皮素对非酒精性脂肪肝细胞atp结合框转运子a1mrna表达的影响

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1、槲皮素对非酒精性脂肪肝细胞ATP结合框转运子A1mRNA表达的影响【关键词】槲皮素;非酒精性脂肪肝;人肝L02细胞;三磷腺苷结合框转运子A1　　[Abstract]Objective:TostudytheeffectsofquercetinontheexpressionofATPbindingcassettetransporterA1(ABCA1)mRNAinnonalcoholicfattyliver(NAFL)cells.Methods：HL02cellsfor24htoinduceNAFLmodel,addingquercetinindifferentdosestothecul

2、turemedium.ThelevelofABCA1mRNAiquantitativeRTPCR.Results：Aftertreatmentetime.Conclusion：QuercetinhadsomeinhibitoryeffectsonNAFLcellsandtheeffectonthesecellsainlyrelatedtotheupregulationofABCA1.　　[Keya公司，RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。总RNA提取试剂盒(Trizol)为上海生物工程公司产品。其余试剂均为国产分析纯。ABCA1和GAPDH引物均由上海生物工程公司合成。　

3、　1.2方法　　1.2.1人肝L02细胞培养及NAFL模型的建立人肝L02细胞培养接种于50ml培养瓶中，将含体积分数10%的灭活胎牛血清、100U/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基，置37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的孵箱内培养，每48h换液1次，在细胞达1×109时用完全培养基重新悬浮，并以1∶3的比例传代，取对数生长期细胞进行实验。实验前用无血清的RPMI1640培养24h，使细胞周期同步化。参照范建高等[2]方法，在更换新鲜培养液后加入50%的胎牛血清，继续培养24h，即形成非酒精性肝脂肪变性模型(镜像比较造模前后细胞内的脂滴变化，组织学

4、上低倍镜下每单位面积见1/3以上的肝细胞脂肪变性和脂肪储积，无其他明显组织学改变)。加入槲皮素共同孵育24h。　　1.2.2实验分组实验分为正常肝细胞组(培养24h+24h)，NAFL模型组(造模24h+24h)、小剂量组(造模24h后，加槲皮素使其终浓度为10μmol/L，共同孵育24h)、中剂量组(造模24h后，加槲皮素使其终浓度为20μmol/L，共同孵育24h)、大剂量组(造模24h后，加槲皮素使其终浓度分别为40，80μmol/L，共同孵育24h)、普罗布考对照组(造模24h后，加普罗布考使其终浓度为10μmol/L，共同孵育24h)。实验重复5次，结果取平均值。　　1.2.3A

5、BCA1mRNA的RTPCR检测收集培养的细胞，按Trizol试剂的说明书，分别提取总RNA，用紫外分光光度计定量后，调整RNA的浓度为0.2g/L。RTPCR的反应体系为：两对引物各1.0μl，10×缓冲液5μl，25mmol/LMgSO41μl，10mmol/LdNTP混合物0.5μl，DNA聚合酶0.5ml及逆转录酶0.5μl，用去离子水补至25μl。反应条件为：48℃45min,94℃3min;94℃90s,58℃1min，72℃1min，共28个循环后，再于72℃延伸7min。取RTPCR产物5μl，在10g/L含溴乙啶的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，在紫外灯下观察结果。RT

6、PCR引物序列参照文献设计如下：ABCA1上游引物5′GGGAGGCTCCCGGAGTT3′，下游引物5′GTATAAAAGAAGCCTCCGAGCATC3′，PCR扩增产物长度为1352bp;GAPDH引物序列设计如下:上游引物5′TCACCATCTTCCAGGAGCGAG3′，下游引物5′TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG3′,PCR扩增产物长度为697bp。　　1.2.4统计学分析实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组数据的比较采用单因素方差分析，组间两两比较用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。全部资料均用SPSS12.0统计软件进行分析。　　某些蛋白质可

7、以参与肝细胞中的游离胆固醇胞内移动及出胞，理论上亦可影响胆道胆固醇分泌。长期以来人们都认为胆固醇的转运依赖于磷酸脂的转运而非蛋白质介导，但实际上对磷酸脂和胆固醇的协同尚不十分肯定。尽管到目前为止没有一个胆固醇转运蛋白被确定下来，但是很可能存在一种蛋白质介导的胆固醇转运。ABCA1是ATP结合框转运子超家族的成员，存在于不同的组织,尤其在肝脏表达较多，通过水解ATP转运许多底物到不同的部位。由于发现ABCA1基因变异与丹吉