槲皮素对体外培养肝细胞胆固醇合成与外流的影响

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1、·原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：年月日关于学位论文使用授权说明本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者签名

2、：导师签名：日期：年月日····-1-····槲皮素对体外培养肝细胞胆固醇合成及外流的影响中文摘要目的：探讨植物化学物质槲皮素(Quercetin)对脂肪变性人肝L-02细胞脂滴形成、胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶和三磷酸腺苷结合框转运子A1、G5、G8等胆固醇外流途径主要相关基因表达的作用及细胞内胆固醇、胆固醇酯含量的影响，了解槲皮素对肝细胞胆固醇合成及转运的作用，并探讨其作用机制。方法：取正常人肝L-02细胞，和经50％胎牛血清造模24小时建立的脂肪变性肝细胞模型，共同作为研究对象。实验分为8组：第一组为空白对照，即正常肝细胞组；第二组为脂肪变性肝细胞组；第三组至第六组

3、在脂变细胞中分别加入不同剂量槲皮素，使槲皮素终浓度分别为10µmol/L、20µmol/L、40µmol/L、80µmol/L；第七组为药物对照组，即脂肪变性肝细胞加入普罗布考，使其终浓度为10µmol/L；第八组为正常肝细胞加20µmol/L槲皮素对照组。每组加药后继续孵育24小时。用MTT法观察槲皮素对脂肪变性人肝L-02细胞模型增殖的影响；油红O染色观察每组细胞内脂滴的形成情况；高效液相色谱法（HPLC）检测细胞内胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）和胆固醇酯(CE)的含量，并计算细胞内CE/TC比值及培养基FC含量；RT-PCR法检测每组肝细胞HMG-CoA还原酶及ABCA

4、1、ABCG5、ABCG8mRNA水平的表达；从而确定槲皮素降低细胞CE的最佳浓度，作出量效关系。然后以槲皮素的最佳浓度处理细胞不同的时间，即6小时、12小时、24小时、48小时，再分别检测各组细胞HMG-CoA还原酶和ABCA1、ABCG5、ABCG8mRNA水平的表达，高效液相色谱法检测细胞胆固醇含量，确定槲皮素降低细胞CE的最佳时间，作出时效关系。实验数据以±s表示，用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析，以P﹤0.05作为差异显著性标准。结果：经50％胎牛血清孵育24小时后，倒置显微镜下可观察到L－02细胞脂肪变性，胞浆内充满大量可被油红O红染的脂滴，且高效液相色谱

5、法检测细胞内外胆固醇含量均明显增加（P﹤0.05）,示脂变肝细胞模型成功建立。经不同浓度的槲皮素（10µmol/L、20µmol/L、40µmol/L、80µmol/L）处理脂肪····-3-····变性肝细胞24小时，结果显示：槲皮素对脂肪变性人肝L-02细胞增殖有明显抑制作用，油红O染色表明，细胞内脂滴较处理前减少。槲皮素呈浓度依赖性的降低脂变肝细胞细胞内TC、CE，增加培养基中FC含量，同时呈浓度依赖性的减少HMG-CoA还原酶的表达、增加ABCA1、ABCG5、ABCG8mRNA的表达。将40µmol/L的槲皮素与脂肪变性肝细胞共同处理6，12，24，48小时,结果显示：

6、细胞内脂滴呈时间依赖性减少；槲皮素呈时间依赖性的降低脂变细胞内TC、CE，增加培养基中FC含量，同时呈时间依赖性的减少HMG-CoA还原酶的表达、增加ABCA1、ABCG5、ABCG8mRNA的表达。结论：1、脂肪变性人肝L-02肝细胞中总胆固醇及胆固醇酯的含量均增加；2、槲皮素能降低脂变人肝L-02细胞总胆固醇及胆固醇酯含量，增加游离胆固醇的外流；3、槲皮素降低胆固醇作用机制可能是通过下调胆固醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶的表达，上调胆固醇转运的重要蛋白ABCA1、ABCG5、ABCG8等的表达，且其作用效果呈现一定的剂量依赖性和时间变化规律。关键词：槲皮素，人肝L－02细

7、胞，胆固醇合成，转运蛋白，HMG-CoA还原酶，ABCA1，ABCG5，ABCG8····-4-····EffectsofquercetinoncholesterolsynthesisandtransportinhumanL-02hepatocyteAbstractObject:Thepurposeofthisstudywastoinvestigatetheformationoflipiddropletsandexpressionofcholesterolrate-limitin