铁催化酒精诱导肝细胞损伤机理的研究

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1、ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyinScienceIronPromotesHepatocyteInjuryInducedbyAlcoholPh.D.Candidate:YanXuMajor:InorganicChemistrySupervisor:Prof.ZhonghongGaoHuazhongUniversityofScienceandTechnolog

2、yWuhan,Hubei,P.R.ChinaAugust29,2012独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文

3、的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在___年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要铁是生物体内重要的微量元素，参与细胞内多种氧化还原反应，调节细胞生长分化。但是铁在体内的大量聚积，可以诱导机体内活性氧水平的上升，引起生物大分子（蛋白质、DNA和脂质）的氧化，最终对机体造成损伤

4、。在酒精性肝病发生的过程中，铁有重要的作用。酒精性肝病患者的肝组织中通常存在大量铁的聚集。虽然现在已经有动物研究表明铁对酒精引起得肝脏损伤具有正协同的作用，但是还没有在细胞水平研究铁对酒精诱导肝细胞损伤的影响。黄酮类化合物是广泛存在于植物中的多酚类物质，也是多种具有益生作用植物的有效成分。大量的动物实验证明，很多黄酮类化合物对于慢性或急性酒精刺激诱导的肝损伤，具有一定的治疗或预防效果。但是没有构建出合适的铁-酒精肝细胞损伤模型用于筛选治疗或预防酒精性肝损伤的黄酮类化合物。本文从细胞水平实验入手，首先分析了

5、不同形态的铁的催化氧化能力与肝细胞损伤之间的关系；然后利用从中筛选的柠檬酸铁作为外源铁添加剂，在HepG2细胞（在该细胞系中CYP2E1不表达）中，研究了铁的催化氧化的作用对酒精诱导氧化应激的影响，以及黄酮类化合物保护作用的机理。主要结果如下：（1）不同形态的铁催化氧化的能力与肝细胞损伤之间的关系。首先，在体外化学体系上研究了高铁血红蛋白以及三种非蛋白结合小分子铁化合物——氯高铁原卟啉、柠檬酸铁和EDTA-Fe（III）——催化氧化的能力。再以人肝癌细胞系HepG2为研究对象，采用MTT法检测细胞活性，A

6、nnexinV/PI双染法流式检测细胞凋亡，免疫荧光的方法检测细胞蛋白质硝基修饰的情况和4-HNE的水平，免疫沉淀和蛋白质印迹的方法检测α-烯醇酶的表达和硝化。结果显示：在体外化学体系中，氯高铁原卟啉和高铁血红蛋白具有较强的催化氧化的能力，柠檬酸铁基本上没有催化氧化的能力，EDTA-Fe（III）催化氧化的能力相对较弱；在细胞水平上，氯高铁原卟啉和EDTA-Fe（III）可以促进葡糖糖氧化酶（GO）/葡糖糖（G）-NaNO2体系诱导细胞凋亡的程度，氯高铁原卟啉铁的作用要明显高于EDTA-Fe（III），柠

7、檬酸铁和高铁血红蛋白构建的Fe（III）-GO/G-NaNO2体系不能诱导细胞凋亡；不同I铁构成的Fe（III）-GO/G-NaNO2对于细胞内蛋白质的表达和硝化、脂质过氧化的影响不同。这表明：在体外化学体系中，含铁化合物催化氧化的作用，主要依赖卟啉铁的参与；在细胞体系中，含铁化合物对肝细胞内蛋白质表达或硝化、脂质过氧化、细胞凋亡的影响和它自身催化氧化的能力没有直接的关系。（2）柠檬酸铁促进酒精诱导的HepG2细胞内氧化应激及黄芩苷的作用。以HepG2细胞（在该细胞系中CYP2E1不表达）为研究对象，采用

8、MTT法检测细胞活性、AnnexinV/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡、免疫荧光的方法检测细胞iNOS表达、蛋白质酪氨酸硝化和4-HNE的水平、蛋白质印迹的方法检测细胞内蛋白质羰基化程度和ERK1/2磷酸化的程度、用DCFH和DMA-DA荧光探针检测细胞内ROS和NO的水平，研究了铁对酒精诱导的氧化/硝化应激的影响以及黄芩苷的作用。结果表明：铁对酒精诱导的细胞内ROS、NO、蛋白质羰基化、蛋白质酪氨酸硝化和脂质过氧化水平的上